Estudio antileishmanial y citotóxico bio-guiado de fracciones y sub-fracciones de  Bio-guide antileishmanial and cytotoxic study of fractions and sub-fractions from Pluchea carolinensis (Jacq.) G. Don (Asteraceae)

Marley García Parra; Ramón Scull Lizama; Lianet Monzote Fidalgo

Estudio antileishmanial y citotóxico bioguiado de fracciones y subfracciones de Pluchea carolinensis (Jacq.) G. Don (Asteraceae)

ARTÍCULO ORIGINAL

Estudio antileishmanial y citotóxico bioguiado de fracciones y subfracciones de Pluchea carolinensis (Jacq.) G. Don (Asteraceae)

Bioguided antileishmanial and cytotoxic study of fractions and subfractions from Pluchea carolinensis (Jacq.) G. Don (Asteraceae)

Marley García Parra,^I Ramón Scull Lizama,^II Lianet Monzote Fidalgo^III

^I Dirección de Economía y Planificación de Guanajay, Artemisa, Cuba.
^II Departamento de Farmacia, Instituto de Farmacia y Alimentos, Universidad de La Habana, Cuba.
^III Instituto de Medicina Tropical Pedro Kourí (IPK). La Habana, Cuba.

RESUMEN

Introducción: Los productos naturales han jugado un papel importante en el proceso del descubrimiento de fármacos, en particular frente a la leishmaniasis. En estudios previos, el extracto de Pluchea carolinensis (Jacq.) G. Don (Asteraceae) mostró actividad in vitro e in vivo frente a Leishmania amazonensis.
Objetivo: Evaluar la actividad antileishmanial y citotoxicidad de fracciones y subfracciones de P. carolinensis a través de un proceso bioguiado.
Métodos: se realizaron fracciones de P. carolinensis utilizando solventes de polaridad creciente (Pc-A a Pc-D) y subfracciones a través de columna Sephadex LH-20 (Pc-D1 a Pc-D11 y Pc-Dr). Las fracciones y subfracciones se sometieron a un proceso de evaluación bioguida, que incluyó la actividad frente a amastigotes intracelulares de L. amazonensis y su citotoxicidad frente a macrófagos peritoneales de ratón BALB/c.
Resultados: La fracción Pc-D fue la de mayor actividad frente a amastigotes intracelulares de L. amazonensis (CI₅₀= 27,1 ± 1,6 µg/mL); mientras que la subfracción Pc-D3 mostró los valores más bajos de CI₅₀ (41,5 ± 1,6 µg/mL) con un índice de selectividad mayor que 5.
Conclusiones: P. carolinensis constituye una fuente potencial de nuevos fármacos y el fraccionamiento del extracto crudo puede influir al aumento de su actividad y la disminución de la citotoxicidad.

Palabras Clave: Leishmania; Pluchea; extractos de plantas.

ABSTRACT

Introduction: Natural products have been playing an important role in the process of pharmaceutical discovery, in particular against the leishmaniasis. In previous studies the extract from Pluchea carolinensis (Jacq.) G. Don (Asteraceae) showed in vitro and in vivo activity against Leishmania amazonensis.
Objective: To evaluate the antileishmanial activity and cytotoxicity of fractions and subfractions of P. carolinensis through a bioguided process.
Methods: Fractions from P. carolinensis were obtained using different solvents of increased polarity (Pc-A to Pc-D), and sub-fractions through a Sephadex LH-20 column (Pc-D1 to Pc-D11 and Pc-Dr). The fractions and subfractions were evaluated through a bioguided process that included the activity against intracellular amastigotes of L. amazonensis and its cytotoxicity against peritoneal macrophages of BALB/c mice.
Results: Pc-D fraction was the most active against intracellular amastigotes of L. amazonensis (IC₅₀= 27.1 ± 1.6 µg/mL); while the Pc-D3 subfraction showed the lowest IC₅₀values (41.5 ± 1.6 µg/mL) with a selective index > 5.
Conclusions: Considering the antileishmanial activity, we could suggest that P. carolinesis constitutes a potential source of new drugs, and fractionation of the extract can also influence in the increase of its activity and in the decrease of citotoxicity.

Keywords: Leishmania; Pluchea; plant extracts.

INTRODUCCIÓN

Los parásitos kinetoplástidos que causan la leishmaniasis son endémicos en 98 países de los cuatro continentes principales, afectan la salud y la viabilidad económica de la mayor parte de los países subdesarrollados.¹ Su impacto está asociado fundamentalmente con la pobreza. Se ha estimado una prevalencia de 14 millones de casos en todo el mundo, con dos millones de nuevos casos cada año. Dentro de las infecciones causadas por las enfermedades tropicales desatendidas, la leishmaniasis constituye, la segunda en mortalidad y la cuarta en relación a la morbilidad.² La epidemiología de esta enfermedad es compleja, involucrando ciclos antropozoonóticos que dependiendo de las especies de Leishmania, implican una gran diversidad de vectores flebótomos y reservorios mamíferos.³

A pesar de los considerables progresos realizados en la comprensión de la bioquímica, la fisiología y la biología molecular de Leishmania, el control de esta parasitosis se basa principalmente en la quimioterapia.^4,5 Sin embargo, los fármacos de primera y segunda línea que se utilizan en la actualidad para su tratamiento tienen limitaciones, producto de su toxicidad, costo y administración. Por otra parte, la aparición de resistencia a los medicamentos convencionales indica que hay una necesidad urgente de desarrollar nuevas y eficaces terapias.⁶

Los productos naturales han jugado un papel importante en el proceso del descubrimiento de fármacos. Varias plantas medicinales se han utilizado tradicionalmente para el tratamiento de la leishmaniasis y se han aislados algunos compuestos promisorios.⁷ El género Pluchea de la familia Asteraceae, comprende 80 especies distribuidas principalmente en Norte y Sudamérica, África, Asia y Australia. Las diferentes especies de este género son conocidas por sus usos etnomédicos.⁸En el laboratorio se evaluaron diferentes extractos crudos de tres especies de este género. En particular, el extracto etanólico de P. carolinensis (Jacq.) G. Don fue el que mostró mayor actividad in vitro e in vivo frente a L. amazonensis.⁹ En este estudio, se evaluó la actividad antileishmanial y citotoxicidad de fracciones y subfracciones de P. carolinensis a través de un proceso bioguiado.

MÉTODOS

FRACCIONAMIENTO DEL EXTRACTO DE P. CAROLINENSIS

Se colectaron las hojas de P. carolinensis durante el mes de marzo del 2006, en el Jardín Botánico Nacional (GBN, La Habana, Cuba) y un espécimen fue depositado con el número de espécimen HFC- 9700158. Las muestras de P. carolinensis se secaron en un horno con un sistema de ventilación a 30 °C y se trituraron. Los extractos fluidos se prepararon por maceración durante siete días, utilizando una mezcla de etanol: agua, 7:3, V:V acorde a la Norma Ramal: NRSP 309 (Medicamentos de origen vegetal: Droga cruda: Métodos de ensayos. La Habana: Ministerio de Salud Pública; 1992. P. 16-29). El disolvente se evaporó y el residuo se liofilizó.

Se realizó un primer paso de fraccionamiento por agotamiento, utilizando diferentes disolventes de polaridad creciente (n-hexano, acetato de etilo y metanol) para obtener tres fracciones Pc-A, Pc-B, Pc-C y residual (Pc-D), respectivamente. El disolvente se evaporó y se liofilizaron las muestras para llevar a cabo las evaluaciones biológicas.

La fracción con resultados prometedores (Pc-D) fue posteriormente subfraccionada en una columna de Sephadex LH-20 de 2 x 30 cm, utilizando metanol como fase móvil, para obtener subfracciones de Pc-D1 a Pc-D11 y un residual (Pc-Dr). Posteriormente, se evaporó el disolvente y se liofilizaron las subfracciones.

En todos los casos, se preparó una solución a 20 mg/mL de las fracciones o subfracciones de P. carolinensis diluidas en dimetilsulfóxido (DMSO) para realizar los ensayos biológicos.

Como fármaco de referencia se empleó la pentamidina (Richet, Buenos Aires, Argentina) a una concentración de 10 mg/mL, la cual constituye un fármaco utilizado clínicamente en el tratamiento de la leishmaniasis.

PARÁSITOS

Se utilizó la cepa MHOM/77//LTB0016 de L. amazonensis, donada por el Departamento de Inmunología de la Fundación Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brasil. Los parásitos se mantuvieron en medio Schneider (SIGMA, St. Louis, MO, EUA), suplementado con antibióticos (penicilina sódica 200 UI, estreptomicina 200 µg/mL) y 10 % de suero fetal bovino (SIGMA, St. Louis, MO, EUA), inactivado con calor (56 °C, 30 minutos).

ACTIVIDAD FRENTE A AMASTIGOTES

Se extrajeron macrófagos peritoneales de ratones BALB/c, mediante lavados con Medio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI; SIGMA, St. Louis, MO, USA) suplementado con antibióticos (penicilina sódica 200 UI, estreptomicina 200 mg/mL). Estas células se infectaron con promastigotes estacionarios a razón de 4 parásitos por macrófago durante 4 horas y se trataron con 10 µL de cada fracción o subfracción a una concentración final entre 12,5 y 100 µg/mL. Después de 48 horas de incubación a 37 °C y 5 % CO₂, se realizaron conteos directos en cultivos teñidos con Giemsa y se calculó la concentración inhibitoria media (CI₅₀) frente a amastigotes (es la concentración que causa el 50 % de inhibición del crecimiento).¹⁰

CITOTOXICIDAD

Para evaluar la toxicidad de los productos, se extrajeron macrófagos peritoneales como se describió previamente. La suspensión celular fue ajustada a una concentración de 3 x 10⁵ células/mL y se distribuyó en placas de 96 pozos incubándose durante 2 horas a 5 % de CO₂ y 37 ºC. Posteriormente, se trataron con las fracciones o subfracciones a concentraciones desde 12,5 hasta 200 µg/mL durante 48 horas. La viabilidad se determinó mediante un método colorimétrico usando una solución de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2,5-difeniltetrazolio) (MTT, SIGMA, St. Louis, MO, EUA) y se determinó la concentración citotóxica media (CC₅₀), que expresa la concentración que causa el 50 % de inhibición del crecimiento.¹¹ Posteriormente, se calculó el índice de selectividad (IS) mediante la división de la CC₅₀ entre la CI₅₀ frente a amastigotes.¹²

Se seleccionaron como candidato(s) potencial(es) la(s) fracción(es) o subfracción(es) que mostraron una CI₅₀ ≥ 50 µg/mL y un IS ≥ 5.¹³

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

La concentración inhibitoria media y la concentración citotóxica media se obtuvo directamente de una curva de regresión lineal en todos los ensayos realizados y fue el resultado de la media de tres réplicas realizadas por separado. Los valores se compararon por Mann-Whitney, al utilizar el programa STATISTICA para Windows, Versión 4.5, de 1993.

RESULTADOS

Como primer paso del fraccionamiento, se obtuvo cuatro fracciones del extracto crudo hidroalcohólico (Fig.), los cuales fueron evaluados frente a L. amazonensis (tabla). La fracción residual Pc-D, mostró la mejor actividad con una CI₅₀ de 27,1 ± 1,6 µg/mL, similar (p> 0,05) a la del extracto crudo (CI₅₀= 0,9 µg/mL).⁹ Con respecto a la citotoxicidad, todas las fracciones mostraron resultados similares, con CC₅₀> 100 µg/mL, excepto la fracción Pc-B con un valor inferior. Sin embargo, la única fracción que mostró un IS ≥ 5 fue la Pc-D. Por estos motivos, la fracción Pc-D fue seleccionada como promisoria y sometida a un proceso de sub-fraccionamiento.

Entre las subfracciones obtenidas, Pc-D4 fue la más activa, con un valor de CI₅₀ de 28,1 ± 3,5 µg/mL; aunque mostró una baja selectividad (IS = 3). Sin embargo, las subfracciones Pc-D3 y Pc-Dr mostraron también una actividad < 50 µg/mL. No obstante, solo la subfracción Pc-D4 mostró un IS > 5.

DISCUSIÓN

Las plantas constituyen una fuente potencial de nuevos compuestos con actividad antiprotozoaria y para la extracción de los mismos se emplean disolventes de diferente polaridad. Para su purificación y aislamiento, los extractos activos de la planta se fraccionan en secuencia, y posteriormente son evaluados para medir su actividad biológica y toxicidad. Esta estrategia se denomina fraccionamiento bioguiado, que permite realizar pruebas simples, reproducibles, rápidas y de bajo costo.^14,15 Las evaluaciones in vitro, por su parte, representan el primer paso para evaluar la eficacia y seguridad de las plantas medicinales para su aplicación en el tratamiento de la leishmaniasis.¹⁵ Este estudio, forma parte de una investigación sistemática etnomédica basada en la búsqueda de compuestos potenciales presentes en P. carolinensis contra la leishmaniasis.⁹

Diversos resultados en la literatura consultada, muestran la actividad de extractos crudos de plantas y sus fracciones contra L. amazonesis. Por ejemplo, el fraccionamiento del extracto etanólico deAzadirachta incrementó su actividad frente a L. amazonensis, las fracciones de diclorometano y cloroformo causaron una CI₅₀ de 1,1 y 0,6 µg/mL, respectivamente , de acuerdo a lo indicado por A. Juss.¹⁶ Las fracciones de diclorometano de las raíces, tallos y hojas de Allamanda schottii Pohl. mostraron valores de CI₅₀ entre 14,0 y 2,0 µg/mL; mientras que el estudio realizado por Filho en 2013, demostró una actividad similar a los resultados reportados en el presente estudio. La fracción de cloroformo de Solanum sisymbriifolium Lam y la de acetato de etilo de Coriandun sativum L. exhibieron una CI₅₀ de 33,8 y 27,3 µg/mL, respectivamente.¹⁷

En conclusión, la Pc-D4 fue la subfracción más activa y selectiva. Esto podría deberse a que los compuestos activos fueron separados en esta subfracción. La caracterización química y la comparación entre las subfracciones podrían dilucidar la causa exacta de la actividad variable obtenida. Las subfracciones de diferentes plantas también han sido estudiadas en varias especies de Leishmania. Por ejemplo, las subfracciones MP2 y MP4 del extracto etanólico de Musa paradisiaca L. fueron activas contra amastigotes de L. chagasi con valores de CI₅₀de 14,2 y 16,5 µg/mL, respectivamente. Igualmente la subfracción Sm1 de Spondias mombin L. muestran resultados similares (CI₅₀= 17,1 µg/mL).¹⁸

Estos resultados apoyan la continuidad del estudio de P. carolinensis como una fuente potencial de nuevos fármacos. Según la actividad antileishmanial mostrada por la subfracción Pc-D3 y por su baja citotoxicidad, podría ser objeto de posteriores estudios donde se realice la purificación de compuestos potencialmente activos contra Leishmania.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no presentan conflicto de intereses.

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Recibido: 15 de diciembre de 2017.
Aprobado: 25 de febrero de 2018.

Lianet Monzote Fidalgo. Departamento de Parasitología. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Autopista Novia del Mediodía Km 6 ^½ AP 601, Municipio Lisa, La Habana, Cuba.

Correo electrónico: rmonzote@ipk.sld.cu

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