ARTÍCULO DE REVISIÓN

Modelos experimentales para la evaluación preclínica de sustancias farmacológicamente activas sobre el Daño Pulmonar Agudo

Experimental models for the preclinical evaluation of pharmacologically active substances on acute lung injury

Licet Mena Valdés, Vivian Molina Cuevas, Yohani Pérez Guerra

Centro Nacional de Investigaciones Científicas (CENIC). La Habana. Cuba.

RESUMEN

El daño pulmonar agudo es una enfermedad frecuente en pacientes hospitalizados con estado crítico de salud. El síndrome de dificultad respiratoria aguda es una de las complicaciones clínicas más severas de esta entidad. Ambos afectan la calidad de vida de los pacientes y presentan elevados índices de mortalidad, lo cual constituye un relevante problema de salud. No existen evidencias de terapias farmacológicas eficaces para tratarlas, por lo que la búsqueda de nuevas estrategias farmacoterapéuticas es un tema de actualidad. Con este propósito, el uso de los modelos experimentales es un recurso de gran utilidad, si bien es preciso tener en cuenta que la adecuada selección de estos garantiza una mayor reproducibilidad y fiabilidad de los resultados. Por tanto, este trabajo de revisión se enmarca en examinar modelos animales ampliamente utilizados en los últimos años, para la evaluación de fármacos con posibles efectos beneficiosos sobre el daño pulmonar agudo y realizar la descripción general de los mismos. Para ello, se recopiló la información expuesta sobre algunos de los modelos animales más empleados, que se encontraba disponible en la base de datos de PubMed, desde enero del 2011 hasta junio 2015. En tal sentido, se realizó una breve descripción del procedimiento experimental característico de cada modelo teniendo en cuenta la especie animal más utilizada, así como las determinaciones bioquímicas y los indicadores inflamatorios y morfológicos más referidos acorde a la literatura consultada. Este documento resume de forma organizada la información actualizada respecto a los diversos modelos animales más utilizados de daño pulmonar agudo/síndrome de dificultad respiratoria aguda, por lo cual resulta una herramienta de consulta para la investigación científica en esta temática.

Palabras clave: daño pulmonar agudo; síndrome de distrés respiratorio agudo; modelo animal.

ABSTRACT

Acute lung injury is a common disease in patients hospitalized with critical health condition. The acute respiratory distress syndrome is one of the most severe clinical complications of this disease. Both affect the quality of life of patients and have high mortality rates, which is a significant health problem. Taking into account that there is no evidence of effective drug therapies for the acute lung injury, the search for new pharmacological therapeutic strategies is a current issue. For this purpose, the use of experimental models is a very useful tool, but it must be taken into account that their appropriate selection guarantees greater reproducibility and reliability of results. Therefore, this review paper is aimed at examining widely used animal models in the last few years for the evaluation of drugs with possible beneficial effects on the acute lung injury and at describing such models. To this end, a brief description of the distinctive experimental procedure of each model was made, with the most used animal species as well as the most cited biochemical determinations and morphological and inflammatory indicators in the consulted literature. This document summarized in an organized way the updated information on the mostly used animal models for acute lung injury /acute respiratory distress syndrome, which prove to be a consultation tool for any scientific research study about this topic..

Keywords: acute lung injury; acute respiratory distress syndrome; animal model.

INTRODUCCIÓN

El síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) fue descrito por primera vez en el año 1967 por Ashbaugh y col¹ en pacientes con ataques agudos de taquipnea e hipoxia. Tomando en cuenta criterios expuestos en la Conferencia de Armonización Americana-Europea de 1994, ² donde se considera el SDRA como un caso particular severo de daño pulmonar agudo (DPA), así como, lo establecido en la conocida definición de Berlín,³ el SDRA se define como un tipo de DPA inflamatorio de causa multifactorial, cuyo marcador morfológico de fase aguda se basa en la presencia de un daño alveolar difuso, que a su vez se caracteriza por signos clínicos de severa disnea, hipoxemia arterial, disminución del rendimiento respiratorio e infiltrados difusos bilaterales.

El DPA/SDRA presenta elevados índices de mortalidad que varían entre el 30 y 60 %;⁴ mientras que las causas más comunes de su desarrollo están relacionadas con la aspiración de contenido gástrico, neumonías, contusión pulmonar, daños pulmonares por inhalación o por reperfusión postransplante de pulmón, ahogamiento, embolia pulmonar, entre otros; o por desórdenes indirectos como la sepsis bacterianas o virales, traumas severos con múltiples transfusiones, el shock de cualquier etiología, bypass cardiopulmonar, sobredosis de drogas, pancreatitis aguda, transfusiones de productos de la sangre, complicaciones quirúrgicas, toxicidad por radiaciones o por exposición a oxígeno, aspiración de ácidos, entre otros.⁵

Los modelos animales enfocados en la patogénesis del daño pulmonar contribuyen a dilucidar detalles específicos de los mecanismos desencadenantes de este daño. Esclarecer la etiología del DPA así como reproducir parcialmente los signos y síntomas clínicos de esta patología, son los objetivos fundamentales de estos modelos, que a su vez constituyen una herramienta clave para la evaluación de nuevos fármacos.

El presente trabajo se enmarca en examinar modelos animales ampliamente utilizados en los últimos años, para la evaluación de ingredientes farmacológicamente activos (IFA) con posibles efectos beneficiosos sobre el DPA y realizar la descripción general de los mismos.

Para garantizar una mejor comprensión de los modelos animales descritos previamente, mostramos un breve resumen de los principales eventos fisiopatológicos involucrados en el DPA.

MECANISMOS FISIOPATOLÓGICOS INVOLUCRADOS EN EL DPA

El DPA se caracteriza por severos signos de hipoxemia, dificultad respiratoria asociada, edema pulmonar no cardiogénico, aumento de la permeabilidad vascular y daño endotelial.^6-8 Generalmente suele secundar situaciones clínicas como: aspiración del contenido gástrico o procesos de sepsis. Puede estar determinado también por episodios de isquemia reperfusión o por la exposición a elevadas concentraciones de oxígeno, de igual modo, las transfusiones de sangre u otros hemoderivados, así como, el proceso de ventilación mecánica (VM), se han asociado a manifestaciones agudas de dificultad respiratoria y DPA.^9-11

La fisiopatología del DPA resulta compleja y multifactorial, por lo cual, no ha sido totalmente dilucidada. Generalmente, se desencadena por factores que deterioran el estado funcional de la membrana alveolo-capilar, ocurriendo la infiltración de polimorfos nucleares (PMN), activación de enzimas oxidantes, secreción de citocinas y producción de moléculas de adhesión, así como de especies reactivas del oxígeno (ERO).¹²

En el desarrollo de la lesión pulmonar en el DPA están involucrados varios mecanismos moleculares, algunos de los cuales se representan en la figura 1. El daño es desencadenado por un estímulo inicial ya sea de forma directa sobre las células endoteliales, provocando su activación y con ello la liberación de mediadores inflamatorios; o indirectamente por la llegada por vía sanguínea del lipopolisacárido (LPS), componente microbiano procedente de bacterias Gram negativas. El LPS se enlaza a proteínas específicas formando complejos que activan los receptores TLR4 (del inglés toll-like receptor 4) en monocitos y macrófagos, que intervienen en la detección de dichos patógenos a través del reconocimiento de patrones de estructuras moleculares únicas presentes en ellos. ¹³ De esta manera se inicia la transducción de señales, mediada por el Factor 88 de diferenciación mieloide (MyD88) que a través del reclutamiento de diferentes cinasas produce finalmente la liberación del factor de transcripción nuclear ( NF- κB). IRAK (Receptor de IL1 asociado a cinasa) fosforilado no solo activa una respuesta inmune innata sino que es capaz de activar la apoptosis por la vía del FADD (del inglés Fas associated death domain Protein), lo cual indica una estrecha relación entre la respuesta inflamatoria y la muerte celular programada.¹⁴

El NF-κB se encuentra en el citoplasma celular en su forma inactiva, unido al inhibidor del factor κB (IκB). Una gran variedad de señales (reconocimiento de antígenos en membrana, activación de receptores de citocinas, TLR) provocan la fosforilación de las cinasas del IκB (IKK), causando su separación del NF-κB. Este último una vez activo se trasloca al núcleo celular, donde promueve la expresión de genes que codifican citocinas, moléculas de adhesión celular, receptores para la adhesión de neutrófilos, etc. El NF-κB es un importante activador intracelular de la respuesta inflamatoria, pues se ha determinado una mayor activación de NF-κB en pacientes con lesión pulmonar aguda,¹⁵ y se ha demostrado además su implicación en la patogénesis de la lesión pulmonar inducida por VM.¹⁶

Por otra parte, los derivados del ácido araquidónico tales como prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos, están implicados como mediadores pro-inflamatorios del DPA.¹⁰ Modificaciones significativas en los niveles de tromboxanos en tejidos, así como de prostaciclinas circulantes promueven la formación de edema y cambios en la perfusión pulmonar debido al incremento de la síntesis de mediadores de la cicloxigenasa 2 (COX-2).^11,17,18

En general el estado de oxidación-inflamación debilita la estructura de la membrana alvéolo-capilar, ocurriendo la migración transendotelial de los neutrófilos a favor de un gradiente quimiotáctico. Una vez en el espacio alveolar, los neutrófilos liberan moléculas pro-inflamatorias como: proteasas, leucotrienos y radicales libres, estos últimos actúan alterando la barrera endotelial y aumentando su permeabilidad, lo cual, ocasiona daños a biomoléculas.¹³

Los macrófagos alveolares al ser activados secretan el Factor Inhibidor de la migración de macrófagos (MIF), quimiocinas y algunas citocinas, entre las que se incluyen las Interleucinas (IL-1, IL-6, IL-8 y IL-10) y el factor de necrosis tumoral (TNF-α), que a su vez estimulan la quimiotaxis y activan a los neutrófilos. El MIF es un regulador esencial de la respuesta de los macrófagos al LPS mediante su efecto sobre la expresión del TLR-4¹⁹ y a su vez, estimula la supervivencia y función de los macrófagos alveolares a través de la supresión de la apoptosis.²⁰

MODELOS ANIMALES

En un contexto ideal, el diseño de modelos experimentales de DPA en animales debe reproducir tanto los mecanismos y consecuencias clínicas de esta patología, así como los cambios fisiopatológicos más evidentes.⁷

En esta revisión se realizó un compendio de algunos de los modelos más empleados para inducir DPA en animales de experimentación, haciendo énfasis fundamentalmente en aquellos que puedan resultar representativos de los principales signos clínicos de esta enfermedad. Para ello, se recopiló la información expuesta sobre los mismos en trabajos publicados únicamente en idioma inglés y en revistas indexadas en una de las mayores bases de datos de publicaciones relacionadas con la medicina y la salud (PubMed) desde enero del 2011 hasta junio 2015. La búsqueda en la base de datos se realizó, para cada modelo animal, teniendo en cuenta las siguientes palabras clave:Acute lung Injury, Animal Model, acompañadas del nombre del modelo, por ejemplo: "Acute lung Injury" + "Animal Model" + " Lipopolysacharide model". Del total de artículos encontrados solo fueron elegibles los trabajos que describían cada modelo de forma independiente y no aquellos que combinaban varios modelos para inducir el DPA. Teniendo en cuenta los criterios de selección antes enunciados se revisaron un total de 752 trabajos originales incluyendo resúmenes y textos completos de libre acceso. En la tabla se exponen los modelos seleccionados y la frecuencia con la que han sido reportados en los últimos años.

Diferentes especies animales han sido empleadas por los autores en los modelos experimentales antes enunciados, si bien es conocido que constituye una de las variables críticas en el desarrollo de estos modelos, teniendo en cuenta las diferencias de susceptibilidad al DPA que se evidencian según variabilidad de las especies.⁷ En la figura 2 se muestra el porciento de artículos de los 752 revisados que utilizan ratas, ratones, conejos u otras especies animales. De manera general los ratones son la especie más utilizada refiriéndose su uso en el 59 % de los artículos examinados.

A continuación se expone una breve descripción de los modelos experimentales ya mencionados, así como las características más relevantes de cada modelo. Se enuncian además los principales indicadores inflamatorios y morfológicos, así como las determinaciones bioquímicas más referidas y la especie animal más empleada para cada modelo según la literatura consultada.

DPA INDUCIDO POR LIPOPOLISACÁRIDO (LPS)

El modelo murino de daño pulmonar inducido por LPS se caracteriza por el incremento de la permeabilidad capilar, edema intersticial y alveolar, así como presencia de células inflamatorias circulantes.⁷ El LPS se enlaza a proteínas específicas formando complejos que activan los receptores CD14/TLR4 en monocitos y macrófagos, desencadenándose la producción de mediadores inflamatorios.^21,22 En este modelo es importante tomar en cuenta la susceptibilidad de las especies al daño inducido por LPS. Es referido por ejemplo que la especie murina BALB/c es más sensible mientras que la especie C57BL/6 es más resistente al daño pulmonar producido por endotoxinas.⁷

El DPA inducido por LPS es uno de los modelos más empleados en la evaluación de fármacos con posibles efectos beneficiosos en el DPA/SDRA. Para su desarrollo se utilizan diversas variantes que se fundamentan en inducir el daño pulmonar por la administración intraperitoneal (i.p),^23-25 intratraqueal,^26-28 intranasal,²⁹ o intravenosa (i.v)^30-32 de determinada dosis de LPS. A continuación se describen dos modelos murinos donde el DPA es inducido por LPS utilizando diferentes vías.

- DPA inducido por instilación intratraqueal de LPS en ratones.

Ratones hembras BALB/c de 6 semanas de edad, son previamente anestesiados para la posterior entubación de un catéter estéril, que permite la instilación intratraqueal de 800 μg de LPS (E. coli 055:B5; Sigma) disuelto en 50 μL de PBS. Transcurridas 72h los animales son sacrificados, se realiza el lavado bronco-alveolar (LBA) según Guo y colaboradores ³³ y se obtiene el tejido pulmonar para su análisis histopatológico. En el fluido del lavado bronco-alveolar (FLBA) se determina la infiltración de neutrófilos haciendo uso de un hemocitómetro. Posteriormente el FLBA es centrifugado a 800xg por 10 min y el sobrenadante es colectado a fin de realizar diferentes determinaciones como: proteínas totales, enzima mieloperoxidasa (MPO),³⁴ albumina, y citocinas proinflamatorias como el (TNF-α), interleucina 1β (IL-1β) e interleucina 6 (IL-6) mediante ensayos ELISA.³³

- DPA inducido por administración i.p de LPS en ratones.

Para el desarrollo de este modelo se administran vía i.p 125 µg/kg de LPS (E. coli 055:B5; Sigma) disuelto en 100 µL de PBS (pH=7,4), ratones machos C57BL/6 de 10 a 12 semanas de edad y un peso corporal de 27 a 30 g. Después de 24 horas los animales son sacrificados y la tráquea es expuesta y canulada con un catéter intravascular. Posteriormente se realiza el LBA mediante dos instilaciones consecutivas de 1,2 mL de solución salina (37 °C). El FLBA colectado es centrifugado a 300xg durante 10 min. El número de células totales se determina en el FLBA fresco mediante conteo celular en un hemocitómetro, además se cuantifica el contenido de macrófagos, linfocitos y neutrófilos. La relación entre el peso húmedo / peso seco de ambos pulmones en función del peso corporal es determinada a través de una primera pesada de los pulmones al ser removidos de los animales y una segunda pesada tras un proceso de secado a 95 °C por 48 horas.³⁵ En modelos similares utilizando la técnica ELISA se determinan los niveles de IL-6 y TNF-α.^{36, 37}

- DPA inducido por ácido oleico

El ácido oleico (ácido 9-cis octadecanoico) es insoluble en agua por lo que para su administración debe ser disuelto previamente en etanol o emulsificado en sangre. La administración debe realizarse por la vena periférica, la vena central o directamente en el atrio derecho de la arteria pulmonar. Dada la especificidad en la vía de administración, este modelo ha sido ampliamente utilizado en ratas o en animales de mayor tamaño y en menor medida en ratones.⁷ La administración intravenosa (i.v) de ácido oleico (AO) provoca inicialmente daño en el endotelio vascular pulmonar, con la subsiguiente inflamación que conlleva al DPA. La administración i.v de AO induce cambios morfológicos celulares similares a los que provoca el DPA/SDRA en humanos.³⁸ Esto lo convierte en un modelo animal ampliamente utilizado para evaluar las potencialidades farmacológicas de algunas sustancias sobre el DPA.

- DPA inducido por administración i.v. de ácido oleico en ratas

Para valorar el DPA inducido por ácido oleico se emplean ratas Wistar albinas hembras entre 140 y 160 g, a las cuales se les administra AO (100 mg/kg) vía i.v. Cuatro horas después son sacrificadas y la sangre es colectada para obtener el suero por centrifugación a 3 000 rpm durante 10 min. Posteriormente ambos pulmones son removidos de los animales para determinar los cambios histopatológicos ocurridos. Se determinan además las concentraciones séricas de malondialdehído (MDA), catalasa (CAT), superóxido dismutasa (SOD) y glutatión peroxidasa (GSH-px).³⁸ Algunas alternativas de este modelo utilizan otros géneros, especies o diferentes dosis i.v. de AO, por ejemplo: ratas Sprague-Dawley hembras (AO: 100 mg/kg);³⁹ o conejos machos Nueva Zelanda (AO: 0,4 mL/kg).⁴⁰ Teniendo en cuenta la magnitud del daño inducido y la variabilidad del modelo se refiere también la determinación de MPO en homogenato de pulmón (1:9 masa: volumen)⁴⁰ y algunas determinaciones inmunohistoquímicas en suero (IL-6, IL- 10, TNF-α).³⁹

- DPA inducido por shock hemorrágico/ reanimación (SHR)

Las hemorragias representan una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en salas de emergencias, salones de operación y unidades de cuidados intensivos. Un proceso hemorrágico se caracteriza por la pérdida del volumen intravascular y subsiguiente inestabilidad hemodinámica, disminución de la perfusión tisular así como del transporte de O₂ y otros nutrientes, hipoxia celular, daño a órganos específicos y eventualmente muerte por shock hemorrágico.⁴¹ El proceso SHR provoca una respuesta inflamatoria sistémica que resulta en fallo multiórganos. En modelos experimentales de inducción de DPA debido a SHR la interacción entre la inflamación y el daño oxidativo desencadenado simulan las condiciones clínicas en humanos,⁴² por lo cual constituye un modelo de primera elección para evaluar el efecto de sustancias farmacológicamente activas en el DPA.

- DPA inducido por shock hemorrágico/ reanimación (SHR) en ratas.

En este modelo animal se emplean ratas Lewis machos entre 250 y 400 g peso corporal, las cuales, son anestesiadas previamente con ketamina (100 mg/Kg), xilacina (10 mg/Kg) i.p. Después de una laparotomía la aorta abdominal es abordada por rotación visceral y equipada con un angiocatéter calibre 22 para monitorear la retirada de sangre y la presión arterial. Finalizado este procedimiento se sutura el abdomen. Después que los animales alcanzan condiciones estables iniciales (5-10 min. posterior a la instrumentación) se les induce la hemorragia hasta alcanzar valores de presión sanguínea arterial de 30 mmHg por 45 min. Posteriormente los animales son reanimados con solución isotónica de cloruro de sodio hasta alcanzar valores estables de presión arterial (70 mmHg) durante 45 minutos. Al final del período de reanimación, los animales son sacrificados por desangramiento rápido. En este modelo se determinan igualmente mediadores involucrados en el DPA como IL-6, IL-10 y TNF-α en tejido de pulmón y músculos pectorales.⁴³ Otras variantes de este modelo determinan además niveles de MPO, MDA y IL-1β y óxido nítrico (ON) en tejido pulmonar.⁴⁴

- DPA inducido por aspiración de ácido

La aspiración del contenido gástrico es valorada por algunos autores^45-47 como un importante factor de riesgo asociado al SDRA en humanos.⁷ Ocurre frecuentemente en pacientes en estado crítico de salud que presentan traumas craneales severos o accidentes cerebrovasculares. Puede presentarse frecuentemente como una complicación de la anestesia general.⁴⁸ El daño pulmonar inducido por la aspiración de ácido es caracterizado histológicamente por una respuesta inflamatoria aguda, que implica mediadores proinflamatorios como algunas prostaglandinas (PGs), tromboxanos (TXs) y leucotrienos (LTs);⁴⁹ seguido de marcada fibrosis, hemorragia alveolar y edema intersticial e intralveolar. Por tal razón un modelo potencial en la inducción del DPA/SDRA en animales de experimentación lo constituye la aspiración de ácido clorhídrico (HCl).⁷

- DPA inducido por instilación intratraqueal de HCl en ratones

Para llevar a cabo este modelo se utilizan ratones BALB/c hembras de 5 a 7 semanas de edad (20 a 25 g de peso corporal), los cuales, son anestesiados con ketamina (50 mg/Kg), xilacina (8 mg/Kg). Posteriormente son administrados por instilación intratraqueal (i.i) con HCl (0,1N; pH 1,5; 50 µL) en el pulmón derecho con un angiocatéter calibre 24. Dos horas antes del sacrificio los animales son inyectados con azul de evans (30mg/kg) en el plexo retrorbital derecho. A las 12, 48 y 72 h siguientes a la i.i de HCl el FLBA es colectado así como el tejido pulmonar. El FLBA obtenido por instilación de 1mL de PBS (tampón fosfato salino) y 0,6 mM de EDTA es centrifugado a 400xg 5 min a 4 °C. La permeabilidad endotelial es evaluada a las 12 horas siguientes a la i.i de ácido mediante la cuantificación en FLBA de la extravasación de azul de Evans a 650 nm. Los niveles de citocinas (IL-6, IL-10, IL-1β) en FLBA son determinados mediante técnicas de ELISA. La dexametasona (1mg/kg, s.c.) es utilizada como fármaco de referencia.⁵⁰

- DPA inducido por Bleomicina

La Bleomicina (BLM) es un antineoplásico del tipo glucopeptídico, aislado de una cepa de Streptomyces verticillos la cual produce radicales libres fuertemente reactivos que dan lugar a la fragmentación de las cadenas de ADN y muerte celular.⁷ La BLM es ampliamente utilizada en neoplasias malignas hematológicas: enfermedad de Hodking, linfomas no Hodking y linfomas cutáneos; así como en tumores sólidos de laringe, ovario y en algunos tipos de sarcomas en segunda o tercera línea.⁵¹ Sin embargo, sus beneficios son limitados dado los efectos secundarios severos que puede provocar: neumonitis, fibrosis pulmonar progresiva y DPA. Su toxicidad sobre el tejido pulmonar es usualmente utilizada en la modelación in vivo para inducir DPA y fibrosis ⁵². En la inducción del daño pulmonar o fibrosis la BLM puede ser administrada por diferentes vías. La vía i.v reproduce el escenario clínico de su administración en humanos, pero requiere dos administraciones semanales durante 4 u 8 semanas, mientras la administración i.i requiere solo una administración.⁷ En ambos casos ocurre el daño caracterizado por el desarrollo de marcada inflamación (0-21 días), seguido de fibrosis (14-28 días),⁵³ si bien, la diana de la administración i.v es el endotelio y para la i.i es el epitelio pulmonar, siendo esta última la vía de elección por su baja complejidad y elevada reproducibilidad.

La BLM es inactivada por la bleomicina hidrolasa, una proteasa cuyos niveles de expresión en pulmón varían de acuerdo a la especie animal. Especies con elevados niveles de expresión de esta enzima como son los conejos presentan mayor resistencia al DPA inducido por BLM, mientras que, ratones C57BL/6 con bajos niveles de expresión de la proteasa son más susceptibles.⁷

- DPA inducido por instilación intratraqueal de BLM en ratones.

Para inducir el DPA por BLM se usan ratones C57BL/6 machos de 8 a 12 semanas de edad, los cuales, son anestesiados para exponer la tráquea. Posteriormente son administrados por (i.i) con BLM (1 mg/kg en 30 µL salina). A 23 días de la i.i de BLM los animales son sacrificados y el FLBA es colectado para determinar el contenido de macrófagos y neutrófilos. Los pulmones son aislados para observar cambios histopatológicos.⁵⁴ En función del objetivo perseguido otros autores varían las dosis de BLM así como el período de tiempo en que se sacrifican los animales.^55-57

- DPA inducido por hiperoxia

La suplementación de oxígeno a pacientes con dificultades respiratorias es una estrategia efectiva y ampliamente utilizada en las unidades de cuidados intensivos, sin embargo, la exposición persistente eventualmente resulta en toxicidad pulmonar irreversible.⁵⁸ La exposición a elevadas concentraciones de O₂ (hiperoxia) ocasionalmente resulta en la aparición de SDRA y puede provocar o exacerbar DPA en pacientes en estado crítico de salud.^{17, 59} El mecanismo celular del daño provocado por hiperoxia sobre el tejido pulmonar puede ser debido a la combinación de procesos de necrosis y apoptosis, si bien, la significación de la apoptosis en la patogénesis del DPA no queda suficientemente esclarecida.⁷

- DPA inducido por hiperoxia en ratones

En este modelo, ratones C57BL/6 hembras de 8 a 10 semanas de edad son introducidos en una cámara hiperóxica (100 % de O ₂) con flujo constante (4.5-5 L/min.). El nivel de O₂ de la cámara es periódicamente verificado y mantenido por encima del 95 %. Luego del periodo de exposición entre 88 a 90 horas, los animales son sacrificados. El FLBA obtenido por instilación de 1mL de PBS y 0,6 mM de EDTA se colecta para realizar el conteo de células totales y células diferenciales. El contenido total de proteínas es determinado en el sobrenadante obtenido tras la centrifugación del FLBA. El tejido pulmonar es colectado para posterior evaluación histológica.⁵⁹ En otra variante de este modelo utilizando ratones machos BALB/c (8 semanas de edad, 20-24 g de peso corporal) los tiempos de exposición a igual porciento de O₂ fueron 12, 24 y 48 horas. Se determinan además en FLBA los niveles de MPO y las enzimas antioxidantes CAT y SOD presentes en homogenato de pulmón así como las concentraciones de MDA, glutatión y niveles de mediadores pro-inflamatorios IL-6 y TNF-α.⁶⁰

- DPA inducido por transfusiones

El daño pulmonar agudo inducido por transfusiones (TRALI, del inglés transfusión associated lung injury) se desarrolla durante o en un periodo de seis horas posterior a la transfusión de una o más unidades de sangre o hemoderivado y no es atribuible algún otro factor de riesgo conocido de DPA.^61,62 Puede ser asociado con la transfusión de sangre total, concentrado de plaquetas y de glóbulos rojos, plasma fresco congelado, concentrado de granulocitos, crioprecipitado y con la infusión de gammaglobulina endovenosa. ^{63, 64} En estados como sepsis, cirugía, daños traumáticos o accidentes y enfermedades crónicas avanzadas, son liberados mediadores inflamatorios intravasculares que activan las células endoteliales (CE) y los PMN,⁶⁵ induciendo procesos inflamatorios que contribuyen al desarrollo del daño pulmonar.⁶⁶

- DPA inducido por transfusiones en ratones

En el desarrollo de este modelo se emplean ratones BALB/c machos de 10 a 12 semanas de edad (22 a 25 g de peso corporal), los cuales, son anestesiados. Posteriormente se aísla la yugular y se inserta un catéter estéril calibre 30. Se aspira sangre venosa para confirmar la posición intravascular de la aguja previo a la infusión de anticuerpo MHC-1 (IgG_2a, 4,5mg/kg). Posteriormente la piel es suturada y a las 2 horas los ratones son sacrificados, drenando la arteria carótida. El pulmón izquierdo es colectado para determinar la relación peso pulmón/peso corporal. Luego de pesado se homogeniza en 0,9 % de solución salina utilizando un homogenizador de tejidos, después de la centrifugación el sobrenadante es utilizado para determinar los niveles de proteína y citocinas. El pulmón derecho es lavado tres veces con 0,5 mL de salina y el FLBA es colectado para determinar proteínas totales y mediadores inflamatorios.⁶⁷

- DPA inducido por isquemia/reperfusión (I/R)

En los pulmones se evidencian dos sistemas vasculares: la circulación pulmonar y la circulación bronquial. Los modelos de I/R pulmonar se basan en someter al pulmón a la disminución del flujo sanguíneo durante un tiempo (isquemia) y posteriormente restablecer la circulación sanguínea (reperfusión). La isquemia puede ser inducida por oclusión directa de la arteria pulmonar, preservando la circulación bronquial o por oclusión del hilum deteniendo totalmente la circulación sanguínea. Los procesos isquémicos a nivel pulmonar se caracterizan por el aumento de la permeabilidad vascular y edema, infiltración de PMN y hemorragias ocasionales.⁷ El transplante de hígado,⁶⁸ riñón⁶⁹ y pulmón⁷⁰ son procesos quirúrgicos cada vez más empleados en pacientes con patologías hepáticas, renales o pulmonares avanzadas, respectivamente. Sin embargo, dentro de sus principales complicaciones se encuentra el daño pulmonar por I/R que en el transplante de pulmón constituye la mayor causa de morbimortalidad en las 72 horas siguientes al transplante.¹² Por otra parte, el mayor índice de mortalidad por daño renal agudo (DRA), asociado al transplante de riñón, está determinado por el daño que ocurre a nivel pulmonar, denominado DPA inducido por órgano a distancia que se caracteriza por un cuadro clínico significativo de edema intersticial, hemorragia focal alveolar e infiltración de células inflamatorias.⁷¹ Los modelos experimentales de DPA inducido por procesos de I/R son variables dado que el daño principal ocurre en pulmón pero puede ser inducido directa o indirectamente sobre este órgano.

- DPA inducido por I/R pulmonar unilateral en ratas.

Este modelo de I/R pulmonar es desarrollado empleando ratas Sprague Dawley machos entre 200-400 g, las cuales, son anestesiadas con isoflurano. Los animales son ubicados en una mesa caliente para mantener la temperatura corporal durante el procedimiento quirúrgico. La arteria femoral es previamente ubicada para colectar la sangre así como medir la frecuencia cardíaca y la presión sanguínea. Se realiza además la traqueotomía y las ratas son ventiladas con FiO₂ (0,6-7 mL/kg a razón de 85 inspiraciones por minuto). Son administradas i.p con sulfato de atropina (0,4 mg/kg), heparina (500 U) y 0,9 % de cloruro de sodio (1,5 mL, cada una hora). Mediante una incisión en la cual el tórax es expuesto se obtiene acceso al hilum izquierdo. La arteria pulmonar izquierda, vena y bronqueo son aisladas del tejido conectivo y posteriormente se ocluyen utilizando una pinza microvascular para inducir la isquemia. Luego de 60 minutos la pinza microvascular es removida permitiendo la reperfusión y ventilación durante 120 minutos. La sangre arterial es obtenida antes y después de la reperfusión. Posteriormente los animales son sacrificados y los pulmones son colectados para determinar mediante estudios histopatológicos el grado de infiltración de PMN, la identificación de zonas hemorrágicas, así como la actividad de MPO por inmunohistoquímica. Se determina además la actividad de la caspasa-3 como indicador de apoptosis en el ensayo MTT para evaluar la viabilidad celular.⁷¹ De igual modo es referido en este y otros modelos similares de I/R mediante la técnica Western Blots la determinación de la expresión de la proteína TRL_4.^72,73

- DPA inducido por I/R en órgano a distancia

Para inducir el DPA por órgano distante se utilizan ratas Wistar machos de edad adulta con un peso corporal de 189±3,36 g, las cuales, son anestesiadas con Ketamina (75 mg/Kg, i.p), Xilacina (10 mg/Kg, i.p). Se realizan dos pequeñas incisiones en la piel del lomo de los animales para acceder a los riñones y exponer las arterias y venas de ambos riñones, que una vez localizadas son ocluidas durante 45 minutos. Posteriormente se retiran las pinzas de oclusión y comienza la reperfusión de sangre. A las 72 horas de inducida la I/R los animales son anestesiados nuevamente y la tráquea es canulada con un tubo para la ventilación. Se implanta un catéter en la arteria carótida para obtener muestras de sangre y se aísla la yugular para inyectar una solución de azul de Evans (10 mg/Kg). Inmediatamente el riñón derecho es extraído manteniendo las condiciones de anestesia y ventilación necesarias. Una hora después de la inyección de azul de Evans las ratas son sacrificadas y se colectan muestras de pulmón y del riñón izquierdo, que son fijadas en 10 % de formalina para realizar estudios patológicos. Los pulmones son utilizados además para evaluar la formación de edema y la permeabilidad vascular en función del azul de Evans extravasado. El riñón derecho es homogenizado y centrifugado a 15 000xg por 2 min y en el sobrenadante se determinan las variables bioquímicas ON y MDA. Además se determinan niveles séricos de creatinina, urea, ON y MDA. El contenido de agua pulmonar es calculado estableciendo la relación peso húmedo/peso seco.⁷⁴ Otros autores refieren el desarrollo del DPA mediante inducción de daño renal por I/R,^75,76 centrando la atención en marcadores de daño histológico sobre pulmón, así como, la determinación de la expresión de marcadores génicos involucrados en este daño.⁷⁷

Cuadro. Resumen de las principales características y mecanismos involucrados en los modelos animales descritos de daño pulmonar agudo