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ARTÍCULO ORIGINAL
Valoración microbiológica de un aceite ozonizado ® antibacterial y reparador mediante prueba de eficacia antimicrobiana
Microbiological assessment of a antibacterial, repairing ozonized oil through an antimicrobial efficacy test
Arias Palacios Janeth,I Murcia Rubiano FernandoII
I Grupo Biotecnología Ambiental
e Industrial. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana.
II Director Científico Laboratorios Biotrends.
SAS.
RESUMEN
Objetivo: evaluar la eficacia del aceite
ozonizado antibacterial.
Métodos: se evaluó el aceite
ozonizado frente a cepas de microorganismos, Aspergillus níger ATCC
16404, Candida albicans ATCC 10231, Staphylococcus aureus ATCC
6538, Escherichia coli ATCC 8739 y Pseudomonas aeruginosa ATCC
9027. La valoración se realizó mediante el test de eficacia descrito
en la Farmacopea USP 36; de acuerdo con la cantidad de microorganismo eliminados
o cuya proliferación sea inhibida a lo largo de un plan de muestro (28
días).
Resultados: se encontró una reducción
de 99,10 % (2,05 ciclos logarítmicos) a los 14 días de incubación
que se mantuvo hasta los 28 días de incubación para todos los microorganismos.
Conclusión: el preservante es efectivo
frente a la eliminación de microorganismos.
Palabras clave: aceite ozonizado; eficacia antimicrobiana; gel reparador.
ABSTRACT
Objective: To evaluate the efficacy of
an antimicrobial ozonized oil.
Methods: The effect of an ozonized oil
against Aspergillus níger ATCC 16404, Candida albicans ATCC
10231, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC
8739 and Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 strains was evaluated. For
this end, the efficacy testing described in Pharmacopeia USP 36 was used, on
account of the amount of killed microorganisms or their growth inhibited throughout
a sampling plan (28 days).
Results: A 99.10
% reduction was found at 14 days of incubation (2.05 log cycles) which
was kept up to 28 days for all the microorganisms.
Conclusion: The ozonized oil is efficacious
to eliminate microorganisms.
Keywords: Ozonized oil, antimicrobial efficacy, repairing gel.
INTRODUCCIÓN
La interacción del ozono con moléculas insaturadas —entre ellas las de los aceites de origen vegetal— genera la formación de una mezcla de compuestos químicos tales como ozónidos, trioxolanos y peróxidos. Estos tienen carácter germicida; propiedad que los hace útiles para el tratamiento de heridas infectadas, fístulas, y otros procesos sépticos locales. Por esto, se han convertido en un medio adecuado para el tratamiento local de cierto número de enfermedades.1
Un preservativo antimicrobiano es una sustancia que se adiciona a las formas farmacéuticas no estériles, para protegerlas del crecimiento de microorganismos que sean introducidos inadvertidamente durante o posteriormente al proceso de manufactura. Todos los agentes antimicrobianos presentan propiedades tóxicas; por lo que para la máxima protección del paciente, la concentración de preservativo en el producto final debe ser considerablemente más baja que la concentración que pueda ser tóxica para el hombre.2
Los agentes antimicrobianos no sustituyen las buenas prácticas de manufactura. Estos solo se adicionan a los productos para disminuir el riesgo de una posible contaminación subsiguiente a la fabricación.
Un sistema preservante involucra tanto los preservativos como la constitución físico-química del producto. Factores como pH, Aw, disponibilidad de nutrientes, concentración de agentes tensoactivos, agentes secuestrantes, componentes no acuosos, ingredientes insolubles y materiales interferentes influirán en la preservación de cualquier fórmula cosmética.3,4
En el diseño de la formulación cosmética, es necesario conocer muy bien todas las posibles interacciones del sistema preservativo para asegurar el cumplimiento del objetivo primordial de la preservación: asegurar que el producto es microbiológicamente seguro y estable. La reacción del ozono con los aceites vegetales ozonizados ocurre casi exclusivamente por el doble enlace carbono-carbono presente en los ácidos grasos insaturados. En la ozonización de los ácidos grasos insaturados se forma el compuesto 1,2,3-trioxolano, el cual se descompone rápidamente para dar un compuesto carbonílico y un aldehído. Estas dos especies se recombinan para dar ozónidos, hydroxihidroperóxidos, peróxido de hidrógeno y aldehído. En los estudios realizados por Díaz Gómez y otros, 5 han sugerido que los compuestos peroxídicos, en unión con los ozónidos, están involucrados en los efectos biológicos de los aceites vegetales ozonizados. Diferentes aceites ozonizados han sido estudiados por el Centro de Investigaciones del Ozono de Cuba.5 Alguno de ellos, tal como el aceite de girasol ozonizado, presentan un remarcable efecto germicida de acuerdo a las investigaciones realizadas en este Centro.2 La eficacia de estos productos contra los hongos, bacterias y virus, ha sido ampliamente verificada. También la actividad antimicrobiana del aceite de teobroma ozonizado ha sido demostrada contra la Candida albicans y sus aplicaciones para infecciones por candidiasis ha sido recomendada.5
El ensayo de la eficacia para este producto pretendió conocer la capacidad del mismo frente a diferentes cepas de microorganismos, como parte esencial en la garantía de la calidad del producto cosmético. La meta de este ensayo, determinar el tipo y la concentración mínima efectiva que se requiere para preservar satisfactoriamente el producto. El objetivo del trabajo fue evaluar la eficacia del aceite ozonizado antibacterial.
MÉTODOS
CEPAS DE REFERENCIA ATCC
Las cepas a usar no deben tener más de cinco (5) repiques en relación con el cultivo original ATCC.
- Escherichia coli (ATCC 8739): En la evaluación se utilizó este microorganismo como representante de bacilos Gram negativos fermentadores, que son indicadores de contaminación fecal y de fallas de higiene.
- Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027): En la evaluación se utilizó este microorganismo debido a su patogenicidad, a su presencia en diferentes ambientes y por su capacidad de proliferar en el agua y adaptarse a varios sustratos, a su alta resistencia a varios sistemas de preservativos, a su potencialidad de degradación del producto, y por ser representativo de fallas de higiene en los procesos de manufactura.
- Staphylococcus aureus (ATCC 6538): En la evaluación se utilizó este microorganismo como representante de cocos Gram positivos que son patógenos, están presentes en la piel y pueden presentar inconvenientes en los productos cosméticos durante el uso.
- Candida albicans (ATCC 10231): En la evaluación se utilizó este microorganismo debido a su patogenicidad y porque representa resistencia a los preservativos.
- Aspergillus niger (ATCC 16404): En la evaluación se utilizó este microorganismo debido a que, a menudo, los hongos filamentosos son agentes causales de daño a productos preservados.
PREPARACIÓN DEL INÓCULO (Fase 1)
Se alistó una vasija con el sanitizante en uso, un asa bacteriológica plástica estéril, gradilla con 3 tubos de agar inclinado Triptona de Soya (TSA) o Plate Count (PC), o caja de petri con agar TSA o PC, 2 tubos de agar inclinado o caja de petri con Saboureaud + Cloranfenicol, las cepas de referencia ATCC anteriormente mencionadas. Se encendió la cabina y se dejó circular el aire por espacio de 10 minutos. Se rotularon cada uno de los tubos o cajas con el nombre, código de las cepas ATCC, fecha y responsable. Se realizó repique de las cepas ATCC en los tubos de agar inclinado o cajas de TSA-PC para bacterias y Saboureaud más cloranfenicol para el hongo y la levadura. Los medios de cultivo fueron sometidos a pruebas de esterilidad y promoción de crecimiento de acuerdo con lo que esta descrito en la USP.2,4
ESTANDARIZACIÓN DE LAS CEPAS (Día 2)
A partir de la cepa de cada microorganismo, se realizó una suspensión inicial, en solución salina 0,85 %, equivalente al tubo 1 de la escala de Mc Farland (3 × 108 UFC/mL) para las bacterias y una suspensión de levadura y moho (el inoculo del moho realizarlo en solución salina al 0,85 % con adición de tween 80 al 0,05 %) las cuales se llevaron a recuento en placa para conocer la concentración de dicho inoculo. (La suspensión bacteriana y de levadura puede ser almacenada hasta por 24 h en refrigeración antes de ser utilizada en la prueba, la suspensión del moho puede ser almacenada en refrigeración hasta 7 días).
Se debe tener en cuenta que el volumen del inoculo empleado debe ser del 0,5 a 1 % del volumen de la muestra y este volumen de inóculo debe asegurar que se presente una concentración final de 1 × 105 a 1 × 106 UFC/mL de producto (esto para productos de categoría 1,2 3). Para productos de categoría 4, la concentración final debe estar entre 1 × 103 a 1 × 104 UFC/mL.
Para llegar a obtener la concentración requerida en los productos de categoría 1, 2, 3; los recuentos de levadura y moho deben tener una concentración del inoculo sea de aproximadamente 9 × 107 UFC/mL. Para el caso de las bacterias, al tener una concentración de 3 × 108 UFC/mL en la suspensión inicial, se tomaron 3 mL de la suspensión y se llevaron a 7 mL de agua peptonada para obtener una concentración final de 9 × 107 UFC/mL.
INOCULACIÓN DEL PRODUCTO
En cinco frascos estériles se pesaron o midieron 20 g/mL del producto. Se rotularon cada uno de los frascos con el número de referencia interno de la muestra, fecha y con cada uno de los nombres de los microorganismos o asignándoles un número. (1= E. coli, 2= S. aureus, 3= P. aeruginosa, 4= C. albicans, 5= A. niger).
A partir de los inóculos de los microorganismos en concentración 9 × 107 UFC/mL, se tomaron 0,2 mL y se adicionaron en cada uno de los respectivos frascos de producto. Se homogenizó uniformemente el inóculo sobre la totalidad del producto. Mediante esta adición de 0,2 mL del inoculo a una concentración de 9 × 107 UFC/mL, se obtuvo una concentración final de 9 × 105 UFC/mL en el producto.
Adicionalmente, al montaje de la muestra se trabajó un control positivo.6,7 Para esto fueron tomados cinco frascos con solución salina estéril o caldo tripticasa de soya con un volumen de 20 mL, se inocularon 0,2 mL de las suspensiones de los microorganismos. Finalizado el proceso de inoculación de la muestra se tomaron tubos de dilución de 9 mL de caldo Letheen (agente inactivador o neutralizante-lecitina), se hicieron las respectivas diluciones (10-2, 10-3) para realizar recuento en placa y estimar las concentraciones de los microorganismos. Estos fueron llevados a incubación a 35+/-2 ºC durante 24-48 h para bacterias y 22+/-2 ºC durante 5 días, para mohos y levaduras. El mismo procedimiento fue realizado para el control positivo pero las diluciones se realizaron en tubos de 9 mL de agua peptonada. (Se sugiere realizar diluciones (10-3 y 10-4)). Los frascos con muestra inoculados y el control positivo se llevaron a incubación a 22 +/- 2 ºC, durante el periodo establecido según la categoría del producto.
Nota: La periodicidad de siembra se debe realizar en base al tipo de categoría del producto. Para esto, en los frascos incubados previamente inoculados, se confirmó la concentración mediante recuento en placa. Se debe tener en cuenta que teóricamente la concentración debe disminuir en al menos 1 ciclo logarítmico por lo que las diluciones a servir deben ser inferiores a las realizadas en el día 0.
RESULTADOS
La muestra que se analizó se expuso a los microorganismos en las concentraciones recomendadas:
- Aspergillus níger (ATCC 16404):
Se encontró una reducción de 99,10 % (2,05 ciclos logarítmicos)
a los 14 días de incubación que se mantuvo hasta los 28 días
de incubación. De esta manera, se cumplen los requisitos de USP, que
exige que no se presente incremento del recuento inicial durante el periodo
de evaluación.
- Candida albicans (ATCC 10231): Se
encontró una reducción de 99,10 % (2,05 ciclos logarítmicos)
a los 14 días de incubación que se mantuvo hasta los 28 días
de incubación. De esta manera, se cumplen los requisitos de USP que exige
que no se presente incremento del recuento inicial durante el periodo de evaluación.
- Staphylococcus aureus (ATCC 6538):
Se encontró una reducción de 99,10 % (2,05 ciclos logarítmicos)
a los 14 días de incubación que se mantuvo hasta los 28 días
de incubación. Se cumplió con los requisitos de reducción según
USP, en el que se debe presentar una reducción de bacterias del 99 %
a los 14 días de incubación y mantenerse en este margen luego de
28 días de estudio.
- Escherichia coli (ATCC 8739): Se encontró
una reducción de 99,10 % (2,05 ciclos logarítmicos) a los 14 días
de incubación que se mantuvo hasta los 28 días de incubación.
Se cumplió con los requisitos de reducción según USP, en el
que se debe presentar una reducción de bacterias del 99 % a los 14 días
de incubación y mantenerse en este margen luego de 28 días de estudio.
- Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027): Se encontró una reducción de 99,10 % (2.05 ciclos logarítmicos) a los 14 días de incubación que se mantuvo hasta los 28 días de incubación. Cumpliendo con los requisitos de reducción según USP, en el que se debe presentar una reducción de bacterias del 99 % a los 14 días de incubación y mantenerse en este margen luego de 28 días de estudio.
DISCUSIÓN
La prueba de eficacia de preservativos requiere que se inoculen individualmente especies determinadas de microorganismos. Este enfrentamiento debería incluir representantes de especies de bacterias Gram positivas, Gram negativas, mohos y levaduras y en suficiente cantidad como para permitir que se obtenga información sobre la cinética de la reacción.2,4
Para fines de la prueba, los productos se definen en 4 categorías:
- Categoría 1. Inyectables, otros parenterales incluyendo emulsiones, productos ópticos, productos nasales estériles y productos oftálmicos con bases o vehículos acuosos.
- Categoría 2. Productos empleados de manera tópica preparados con bases o vehículos acuosos, productos nasales no estériles y emulsiones, incluyendo aquellos que se aplican a membranas mucosas
- Categoría 3. Productos orales a excepción de antiácidos, preparados con bases o vehículos acuosos.
- Categoría 4. Antiácidos preparados con una base acuosa.
CRITERIOS PARA EVALUACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS
- Categoría 1: Para Bacterias a los 7 días, se debe presentar una reducción logarítmica de no menos de 1,0 desde el recuento calculado en el inicio; a los 14 días, una reducción logarítmica de no menos de 3.0 del recuento inicial; y ningún incremento del recuento entre los 14 y 28 días. Ningún para levadura y moho incremento a los 7, 14 y 28 días respecto al recuento inicial.
- Categoría 2: Para bacterias a los 14 días, una reducción logarítmica de no menos de 2,0, desde el recuento inicial; y ningún incremento del recuento entre los 14 y 28 días. En levadura y moho ningún incremento a los 14 y 28 días respecto al recuento inicial.
- Categoría 3: En Bacterias a los 14 días una reducción logarítmica de no menos de 1,0 del recuento inicial y ningún incremento del recuento entre los días 14 y 28. Para levadura y moho ningún incremento a los 14 y 28 días respecto al recuento inicial.
- Categoría 4: Para bacterias, levadura y moho ningún incremento a los 14 y 28 días respecto al recuento inicial.
Este procedimiento determina si una solución puede eliminar los microorganismos
inoculados en la solución dentro de un período de tiempo específico.
Después de que los organismos han sido inoculados en la solución por
el tiempo recomendado, el producto deben reducir estos organismos por tres log
para las bacterias y un log completo para los hongos. Un log equivale a una
reducción del 90 %, o 900,000 organismos muertos; una disminución
de dos log denota una reducción del 99 %, o 990,000 organismos muertos;
tres log una reducción del 99,9 %, o 999,000 organismos muertos; cuatro
log equivalen a una reducción del 99,99 %, o a 999,900 organismos muertos;
y cinco log una disminución del 99,999 %, o 999,990 organismos muertos.
El único requisito es una reducción específica en los números
microbianos, expresados como reducción de log, dentro del tiempo especificado
por el fabricante al entrar en contacto el microorganismo con la solución.
Después de observar el comportamiento microbiológico de la muestra con el preservante, se encontró una disminución de 2,05 ciclos logarítmicos en todos los casos; frente a los diferentes microrganismos probados y hasta los 28 días de incubación. Se cumplen los requisitos de United States Pharmacopeia (USP) que exige que no se presente incremento del recuento inicial durante el periodo de evaluación.
Esto contribuye así con la protección, estabilidad microbiológica y seguridad del producto, favorece al futuro la vida útil del producto y garantiza su buen desempeño durante su vida de estantería. Se concluye que el sistema preservante es efectivo frente a la eliminación de microorganismos.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Martínez-Sánchez G. La ozonoterapia gana evidencias científicas en el campo clínico. Rev Cubana Farm. 2013;47(1):1-4.
2. Díaz M, Lezcano I, Molerio J, Hernández F. Spectroscopy Characterization of Ozonides with Biological Activity. Ozone Science and Engineering. 2001;23(1):35.
3. United States Pharmacopeia. USP 36-NF 31. Baltimore, Maryland: United: Book Press, Inc. 2013; p. 56-80.
4. Sechi LA, Lezcano I, Nuñez N, Espim M, Dupre I, Pinna A. Antibacterial Activity of Ozonized Sunflower Oil (OLEOZON). J. Appl. Microbiol. 2001;90(2):279.
5. Díaz Gómez MF. Usos y propiedades
de los aceites vegetales ozonizados. La experiencia cubana. Revista CENIC. Ciencias
Biológicas. 2010;41:1-12.
6. Fernández H, Hernández R, Martínez G, Mora C, Rodríguez M, Hernández D, Curtiellas V, Moreira T. Sistema de Calidad para la Producción de Medicamentos a Base de Aceites Ozonizados. Rev Normalización. 2006;1:30-6.
7. Martínez Sánchez G. Los retos de la ozonoterapia y el acceso a sus fuentes de información. Rev Cubana Farm. 2014;48(3):347-9.
Recibido:1 de enero de 2015.
Aprobado:31 de mayo de 2016.
Arias Palacios Janeth. Grupo Biotecnología
Ambiental e Industrial. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana.
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