Correlación del daño cerebral por estrés oxidativo con alteraciones en el comportamiento después de la abstinencia alcohólica en ratas Lewis

María Teresa Díaz-Soto

Correlación del daño cerebral por estrés oxidativo con alteraciones en el comportamiento después de la abstinencia alcohólica en ratas Lewis

ARTÍCULO ORIGINAL

Correlación del daño cerebral por estrés oxidativo con alteraciones en el comportamiento después de la abstinencia alcohólica en ratas Lewis

Correlation of brain damage caused by oxidative stress with behavioral impairments after ethanol withdrawal in Lewis rats

María Teresa Díaz-Soto, Ángela Fraga-Pérez, Jacqueline Dranguet-Vaillant, María de los Ángeles Bécquer, Mayté Casanova, Maikel Arteaga Cruz, Olga Sonia León-Fernández

Instituto de Farmacia y Alimentos, Universidad de La Habana, Cuba.

RESUMEN

Introducción: un criterio de diagnóstico de la dependencia del alcohol es la aparición de síntomas de abstinencia. Durante la abstinencia alcohólica ocurre incremento de la formación de especies reactivas de oxígeno. Los mecanismos por los cuales ocurre la toxicidad por el alcohol no son totalmente conocidos.
Objetivos: determinar la relación entre los marcadores que indican un daño cerebral inducido por estrés oxidativo y cambios conductuales después de dos semanas de abstinencia alcohólica en ratas.
Método: fueron utilizadas ratas Lewis machos (270-280 g) que se distribuyeron en dos grupos; (Grupo I) recibió agua durante el experimento y (Grupo II) grupo de ratas a las cuales se les fue introduciendo gradualmente el consumo de etanol en soluciones de 10, 20, 30, y 40 % (56 días). Se realizó la prueba de tolerancia farmacológica y determinaron variables bioquímicas relacionadas con el estado redox, en sangre.
Posteriormente se retiró la administración de etanol de forma abrupta. Después de dos semanas de abstinencia alcohólica las ratas fueron sujetas a varios ensayos conductuales (Laberinto Acuático de Morris, Rotarod y Laberinto Elevado en Cruz). Posteriormente se obtuvo tejido de cerebro y se midieron marcadores del daño relacionados con el estrés oxidativo.
Resultados: dos semanas después de la abstinencia alcohólica hubo un incremento (p<0,05) del estrés oxidativo a nivel cerebral. Este se caracterizó por una disminución de la actividad de la superóxido dismutasa y catalasa así como de las concentraciones de glutatión reducido (GSH), indicando una disminución de las defensas antioxidantes. Existió un significativo incremento en las concentraciones a nivel cerebral de malonildialdehido y nitritos/nitratos (una medida de la formación de óxido nítrico). Ocurrieron alteraciones en el grupo II, relacionadas con la memoria y capacidad de aprendizaje, actividad locomotora y ansiedad, correlacionada con las variables redox.
Conclusiones: el estrés oxidativo es un inductor del daño cerebral y está relacionado con afectaciones ocurridas después de dos semanas de abstinencia alcohólica, en nuestras condiciones experimentales. La terapia antioxidante y sus efectos pleitrópicos pudiera considerarse en el tratamiento de la abstinencia alcohólica.

Palabras Claves: abstinencia alcohólica; estrés oxidativo; terapia antioxidante.

ABSTRACT

Introduction: one diagnostic criterion of alcohol dependence is the appearance of a withdrawal syndrome when alcohol consumption ceases. Ethanol withdrawal (EW) increases reactive oxygen species formation. The mechanisms by which oxidative stress contributes to alcohol toxicity are still not fully understood.
Objetive: this study aimed at investigating the relationship between measures of brain damage induced by oxidative stress and behavioral changes after two weeks of EW in rats.
Method: male Lewis rats (270-280 g) were used. Two groups: (I) Control, received tap water for the entire duration of the experiment; and (II) Ethanol (ET-OH), rats were gradually introduced to ethanol consumption through ET-OH solutions from 10, 20, 30 and 40% (56 days). Blood ethanol determination and pharmacologic tolerance were evaluated. Afterwards, ethanol administration was abruptly ceased. After two weeks of EW, rats were subjected to behavioral tests (Morris Water Maze, Rotarod and Elevated Plus Maze) followed by brain tissue collection to measure markers of oxidative damage.
Results: two weeks after EW, a significant increase in brain oxidative stress was found (p˂0.05). This was characterized by a decrease in the activity of superoxide dismutase and catalase as well as in the GSH content, indicating an impairment of the antioxidant defences. Brain levels of malondialdehyde and nitrites/nitrates (a measure of nitric oxide formation) were significantly increased. Behavioral alterations in memory/learning, locomotor activity and anxiety correlated with the redox variables.
Conclusions: oxidative stress is an inductor of brain injury and it is associated with behavioral impairments after two weeks of EW, in our experimental conditions. Antioxidant therapy with pleiotropic effects seems to be promissory in EW treatment.

Keys Words: ethanol withdrawal; oxidative stress; antioxidant therapy.

INTRODUCCIÓN

A nivel mundial el abuso del consumo de etanol está definido por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como el causante del 3,2 % de muertes anualmente, la reducción de 12 años de la expectativa de vida y 4 del total de años de vida productiva por muerte prematura. Existe gran impacto en el continente americano donde las afectaciones relacionadas con el alcohol representan el 9 % de la población total.¹ Debido a principios éticos y dificultades experimentales en el estudio de alcoholismo en humanos, una gran cantidad de investigaciones sobre la temática de la intoxicación y dependencia alcohólica se realizan en modelos animales, que han permitido comprender la fisiología, la bioquímica, a nivel molecular de un determinado comportamiento que se asemeja al comportamiento asociado con el alcoholismo en humanos.²Por otra parte, un criterio de diagnóstico de la dependencia al alcohol es la aparición del síndrome de Abstinencia Alcohólica (AA) cuando cesa el consumo de etanol. Muchas investigaciones utilizan varios modelos animales para estudiar los mecanismos y manifestaciones de la AA. Numerosos resultados de estos estudios experimentales han demostrado que muchas consecuencias de este síndrome encontradas en animales coinciden con las observadas en humanos. Gran cantidad de signos y síntomas de la AA incluyen alteraciones de la actividad del Sistema Nervioso Autónomo (SNA): Postura corporal, anomalías motoras, hiperexcitabilidad del Sistema Nervioso Central (SNC) que incluyen hiperactividad, convulsiones, ansiedad, entre otros.³ La ingestión crónica de altas concentraciones de alcohol puede causar estrés oxidativo que es el resultado de la formación, a través del metabolismo del alcohol, del exceso de radicales libres, acetaldehído, oxidación de lípidos y proteínas y sus productos altamente reactivos.⁴ Por otra parte, el contenido tanto exógeno como endógeno de antioxidantes en el sistema nervioso central (SNC) es muy pobre en comparación con los existentes en otros tejidos. Aductos derivados del metabolismo del etanol se han encontrado en las mismas áreas del cerebro que presentan alteraciones estructurales y funcionales en consumidores crónicos de etanol.⁵ En el cerebro, la mitocondria aparece como el principal "blanco" del estrés oxidativo afectado por intoxicación y AA.⁶Durante la AA existe un incremento del radical anión superóxido, ocurre una excesiva transmisión glutamatérgica lo que aumenta las concentraciones de calcio intracelular y las especies reactivas de oxígeno.⁷ Los mecanismos por los que el estrés oxidativo contribuye a la toxicidad por el alcohol aún no han sido dilucidados.⁸ Teniendo en cuenta lo anterior este estudio se propuso determinar la relación entre los marcadores indicadores del daño cerebral inducido por estrés oxidativo y cambios conductuales (Memoria espacial, actividad locomotora y ansiedad) mediante el Laberinto Acuático de Morris, Rotarod y Laberinto Elevado en Cruz después de dos semanas de abstinencia alcohólica en ratas.

MÉTODOS

Todos los procedimientos realizados estuvieron estrictamente de acuerdos con el Comité de Ética de la Universidad de La Habana y de las regulaciones del Instituto Nacional de Salud (Bethesda, MD, USA) para el cuidado y uso de animales de laboratorio para procedimientos experimentales.

Se utilizaron ratas Lewis macho (250-300 g) provenientes del Centro Nacional de Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB, Mayabeque, Cuba). Las ratas fueron alimentadas con pienso y agua/etanol ad libitum (45 g y 60 g) en cajas hogar bajo ciclos de luz y oscuridad de 12 horas a una temperatura de 20±2 °C. La autoadministración por vía oral fue usada porque el mismo es validado como modelo para asemejar el consumo de etanol en humanos bajo circunstancia en las cuales ellos controlan la cantidad consumida. Las ratas fueron divididas en dos grupos (10 ratas/grupo). Los grupos fueron (I) Control, que recibió agua durante todo el experimento y (II) Etanol (ET-OH), a este grupo gradualmente se le introdujo el consumo de etanol en soluciones desde 10, 20, 30, y 40 % (56 días, tiempo que duró la primera etapa del experimento). Sesenta mililitros de agua o soluciones de etanol fueron colocados en cada caja diariamente por 8 semanas. En una etapa posterior se realizó la prueba de tolerancia farmacológica que consistió en exponer a las ratas del grupo II al consumo libre de agua o etanol. La presencia o no de tolerancia farmacológica fue evaluada mediante la medición de los volúmenes consumidos de agua o etanol durante 24 horas. Posteriormente las ratas alcohólicas fueron sometidas a seleccionar la solución de alcohol entre 10 y 40 % durante dos semanas. Durante este tiempo fue medido el volumen de etanol consumido, posteriormente la administración de etanol cesó abruptamente. Después de dos semanas de abstinencia se evaluaron la actividad conductual y se obtuvo tejido de cerebro para realizar determinaciones relacionadas con el estrés oxidativo.

DETERMINACIÓN DE ETANOL EN SANGRE

La sangre (200 µL) fue extraída del plexo ocular e inmediatamente mezclada con 90 µL de HClO₄ 0,55M congelado. Las muestras fueron centrifugadas a 1 500 g por 10 minutos para sedimentar las proteínas precipitadas. El sobrenadante fue ajustado a pH 5 con 200 µL de una solución que contenía 0,6 M de KOH y 50 de ácido acético los cuales fueron centrifugados para sedimentar el KClO.₄ El etanol contenido en el sobrenadante fue medido por técnica colorimétrica.⁹

EVALUACIÓN DE LOS SIGNOS DE ABSTINENCIA ALCOHÓLICA

Fueron seleccionados tres test conductuales de acuerdo a la correspondencia entre los signos de abstinencia alcohólica en humanos y animales,³ estos incluyen Laberinto Acuático de Morris (LAM), Rotarod y Laberinto Elevado en Cruz. El LAM es una prueba de aprendizaje espacial la cual sirve para aumentar y resaltar la estrecha correlación con la función de los receptores NMDA involucrados en la conducta de refuerzo, y retorno durante la AA.^10,11 Fue usado un LAM estándar. La temperatura del agua se mantuvo entre 25±2 ⁰C, antes de comenzar el experimento, los animales (grupos Control y ET-OH) fueron entrenados durante 5 días con dos sesiones por días. Los animales fueron guiados durante 60 s para encontrar la plataforma sumergida.¹⁰ La descripción de la actividad locomotora mimetizó la agitación psicomotora en humanos durante la abstinencia alcohólica.³ Esta fue evaluada utilizando la prueba del Rotarod. Las afectaciones motoras en este estudio fueron evaluadas con el uso de la velocidad acelerada del Rotarod (Ugo Basile, Varese, Italy, Model 7750). Las ratas (Control y grupo etanol) fueron sometidas a cinco sesiones de entrenamiento por 10 minutos antes de la administración de etanol. Las ratas fueron primero habituadas a la rueda estacionaria. Después fueron expuestas a la rueda rotando. La rueda fue acelerando la velocidad desde 2 r·min^-1 linealmente a 20 r·min^-1 en 300 s, fue determinada la latencia sobre el Rotarod. Los animales fueron entrenados para estar sobre la rueda acelerada por un mínimo de 30 s. Si ellos no cumplían con este criterio, el experimento era repetido por un máximo de cinco veces. Los dos mejores resultados de valores de latencia de cada rata fueron archivados y usados para el análisis de datos, las ratas que no fallaron durante los 5 min fueron tomadas como un máximo de 300 s.¹² La ansiedad es otro signo de abstinencia alcohólica en humanos. Este signo puede ser evaluado en ratas a través de la exploración de espacios abiertos. Fue usado el Laberinto Elevado en Cruz de MED Associates, Inc., St.Albans, VT. Los animales fueron transportados a una habitación inmediatamente continua a la habitación donde se realizaría el ensayo y fueron entrenados para estar habituados aproximadamente 30 minutos antes de comenzar el ensayo. Las ratas fueron colocadas en el laberinto por 5 minutos y recogido el número de veces de entradas en los brazos cerrados y el tiempo de permanencia en los brazos abiertos del laberinto.¹³ El comportamiento conductual de los grupos experimentales fue recogido por dos observadores.

DETERMINACIÓN DE ESTRÉS OXIDATIVO EN HOMOGENADO DE CEREBRO

Al finalizar la etapa de abstinencia alcohólica las ratas fueron sacrificadas por anestesia con Dietil Éter. Posteriormente el cerebro fue removido para el estudio del estrés oxidativo. El homogenado de cerebro fue obtenido usando el homogeneizador Edmund Bühler a 4 ⁰C. Los homogenados fueron preparados usando un buffer de 50 mM Kcal/histidina a pH 7,4, 1:10 (w/v) y fueron centrifugados con una Centrifuga Sigma, a 4 ⁰C y 8 500 g por 20 min. Los sobrenadantes fueron tomados para estudiar el estado del estrés oxidativo en el cerebro después de dos semanas de abstinencia alcohólica, los marcadores del estrés oxidativo fueron determinados por métodos espectrofotométricos usando un Espectrofotómetro Ultrospect Plus procedente de Pharmacia LKB. Los valores de MDA fueron analizados usando el kit LPO-586 obtenido de Calbiochem (La Jolla, CA, USA). En el ensayo la producción de un cromóforo estable después de 40 min de incubación a 45 ⁰C fue medido a una longitud de onda de 586 nm.¹⁴ La cuantificación de Hidroperóxidos Totales fue medida por Bioxytech H2O2-) usando xilenol naranja para formar un complejo coloreado estable, el cual puede ser medido a 560 nm. Las concentraciones de Nitrito/nitrato fueron determinados por la reacción de Griess por la conversión de nitrito a nitrato usando la nitrato reductasa. (Boehringer Mannheim Italy SpA, Milan, Italia). Las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente por 10 min y la absorbancia fue medida a 540 nm usando un lector de microplacas ( Ultrospect PlusSpectrophotometer from Pharmacia LKB (Pittsburgh, PA, USA). La Superóxido Dismutasa (SOD) fue medida usando el kit obtenidos de los laboratorios Randox Ltd., Ireland (Cat. No. SD125 and No. RS505).¹⁵ La actividad de la Catalasa fue medida por el seguimiento de la descomposición de peróxido de hidrógeno a 240 nm por 10 minutos a intervalos de 1 minuto,¹⁶ después de la precipitación de grupos thioles de las proteínas usando TCA al 10 % el Glutatión reducido (GSH) fue determinado de acuerdo al método de Sedlak and Lindsay¹⁷ la absorbancia fue medida a 412 nm. La concentración de proteínas totales fue determinada por el método deBradford con albúmina sérica bovina como estándar.¹⁸

Para el análisis estadístico se aplicó el método ANOVA (modo simple) seguido por la prueba de homogeneidad de varianza ( Bartlett-Box), además, fue usada una prueba de comparación (prueba de Duncan). Para el estudio de correlación entre los ensayos conductuales y las variables redox se utilizó la variable de Pearson. Variables con diferencias estadísticas fue reportada como coeficiente de correlación de Pearson. Los datos fueron expresados como la media ± desviación estándar en 10 animales. Para todos los experimentos los niveles de significancia estadística fueron reportados para p<0,05.

RESULTADOS

INTRODUCCIÓN DEL ALCOHOLISMO Y TOLERANCIA FARMACOLÓGICA

Las ratas (n=10) fueron administradas ad libitum con soluciones de etanol a diferentes concentraciones (desde 10 % a 40 %) por 6 semanas (2 semanas cada concentración).

No existieron diferencias en el volumen de solución etanólica (10 %-40 %) consumido durante la inducción del alcoholismo por 56 días (figura 1) pero el alcohol ingerido (g/Kg por peso corporal) incrementó significativamente (p<0,05) así como concentraciones de solución de etanol incrementada. El consumo diario fue 5,5±0,3 g/Kg, alcanzando una concentración sanguínea de etanol de 195,0±9,3 mg/100 mL. La figura 2 muestra el grupo que ingirió Etanol.

En las ratas convertidas en alcohólicas fue medida la tolerancia farmacológica (figura 3A). Las ratas alcohólicas prefirieron la solución de mayor concentración de etanol (40 %) el volumen consumido fue mayor, en comparación con la solución al 10 % (p<0,05). Al final de la abstinencia alcohólica (2 semanas) el grupo que consumió etanol incrementó el consumo de agua con respecto al grupo control (agua) (figura 3B)

SIGNOS CONDUCTUALES AL FINAL DE LA ABSTINENCIA ALCOHÓLICA

Después de dos semanas de AA las ratas tratadas con etanol mostraron afectación de la memoria espacial (figura 4). Ellas demoraron significativamente (p<0,05) más tiempo para encontrar la plataforma (9 min más que el grupo control (agua). En la prueba realizada previamente del rotarod con aceleración fueron comparables los resultados obtenidos en el grupo que consumiría etanol con el grupo control (agua). Al final de la AA, las ratas alcohólicas mostraron afectación motora (p<0.05). Ellas disminuyeron el tiempo de permanencia sobre la rueda y sólo pudieron permanecer 60 s ( figura 4). La conducta ansiógénica durante la AA medida en el Laberinto Elevado en Cruz se demostró en la figura 4. La AA redujo el número de entradas a los brazos cerrados (en 5 min) y aumentó el tiempo que las ratas permanecían en los brazos abiertos por 29,6 % y 67,7 % respectivamente en comparación con el grupo control.

BALANCE ANTIOXIDANTE-PROOXIDANTE EN HOMOGENADO DE CEREBRO

Los marcadores redox en homogenado de cerebro se muestran en la tabla. Al final de la AA existió un incremento del estrés oxidativo. Las defensas antioxidantes (SOD, Catalasa y GSH) disminuyeron mientras que el MDA (aldehído tóxico y similar al acetaldehído el cual se acumula durante la AA) así como las concentraciones de nitrito/nitrato (un marcador de la generación de óxido nítrico fueron incrementadas (p<0,05). Los hidroperóxidos totales disminuyeron después de las dos semanas de AA sugiriendo la existencia de otras vías conectadas con la producción de las ERO.

CORRELACIONES ENTRE VARIABLES DEL COMPORTAMIENTO CONDUCTUAL EN LA AA Y MARCADORES DEL ESTRÉS OXIDATIVO

El análisis se realizó utilizando el coeficiente de correlación de Pearson para probar la correlación entre los signos conductuales en la AA y el daño oxidativo en el cerebro. Existió una correlación positiva entre los resultados del rotarod y los marcadores relacionados con SOD/HT (p<0,05) así como la entrada a los brazos cerrados (en 5 min) con el GSH (p<0,05) y la relación SOD/GSH (p<0,05), la capacidad de aprendizaje y memoria mostró correlaciones negativas con GSH (p<0,05) y la relación SOD/CAT (p<0,05), la ansiedad (tiempo de permanencia en los brazos abiertos) correlacionó negativamente con dos marcadores del daño oxidativo MDA y HT(p<0,05).

DISCUSIÓN

El consumo excesivo de etanol por un prolongado período de tiempo provocó dependencia alcohólica, se logró un estado neurofisiológico de adaptación que provocó signos y síntomas (semejantes al síndrome de abstinencia alcohólica) cuando el consumo de etanol se redujo drásticamente o se detuvo completamente. Solamente algunos reportes de daño cerebral por estrés oxidativo después de la Abstinencia Alcohólica han desarrollado. Recientemente se realizó un estudio determinando la susceptibilidad del daño que puede provocar el aumento de prooxidantes en SNC de ratas, comprobándose mayor susceptibilidad en ratas macho debido al efecto protector en el sexo femenino del 17β-estradiol.¹⁹ En este estudio dos semanas después de la AA las ratas mostraron desequilibrio del estado redox en el cerebro y afectaciones conductuales relacionadas con la capacidad de memoria, actividad motora y estado de ansiedad. Todas las afectaciones conductuales fueron correlacionadas con los marcadores del estado redox que fueron evaluados. El consumo voluntario de las ratas, así como las concentraciones de alcohol en sangre fueron similares a los reportados para ratas que tienen mayor preferencia por etanol, resultado comparable con los reportados por Buck KJ, y col. en 2012, al realizar un estudio con modelos animales que presentaban una variedad genética en regiones identificadas del ADN que contienen uno o varios genes que provocan afectaciones en el fenotipo con importantes efectos en la severidad de la abstinencia alcohólica, en la respiración mitocondrial y generación de ERO²⁰ (5,3 g alcohol/Kg peso corporal/día y 195 mg/100 5-8 g/Kg. peso corporal/día y 50-200 mg/100 mL, respectivamente).³ Las ratas alcohólicas prefirieron la solución de alcohol al 40 %. El volumen total consumido al 40 % no fue diferente al consumido de agua por el grupo control. Estos resultados sugieren que las ratas pertenecientes al grupo II adquirieron tolerancia farmacológica. Al final de la AA las ratas consumieron un volumen mayor de agua (p<0,05) en comparación con el grupo control. Estos resultados pudieran ser consecuencia de la ansiedad por consumir alcohol el cual fue retirado dos semanas antes, por otra parte, la disponibilidad de agua como el único fluido durante los 14 días obviamente modificaron las condiciones experimentales las cuales pudieron cambiar la preferencia de las ratas como ha sido reportado.²¹ Existió disminución de los sistemas antioxidantes endógenos después de las dos semanas de Abstinencia Alcohólica. Estos resultados se corresponden con los reportados por Ramamourty P y col. en 2015 al evaluar altas concentraciones de MDA durante la AA en un estudio realizado a nivel preclínico, obteniendo como resultado elevada la actividad de la SOD y disminuida la actividad de la enzima catalasa con respecto al grupo control.²²

En el presente estudio disminuyó la actividad de SOD sugiriendo una acumulación de radicales superóxido. Estos resultados coinciden con otros autores que han reportado un incremento de radicales superóxido en tres regiones del SNC en ratas en AA.⁷ La actividad de la Catalasa (Secuestradora de Peróxido de Hidrógeno) fue significativamente menor (p<0,05) en el grupo que consumió etanol en comparación con el grupo Control. La disminución de esta actividad puede indicar una modificación oxidativa de la proteína enzimática causada por radicales libre los cuales son generados durante el metabolismo del etanol a Acetaldehído. Fue observada una disminución del GSH, antioxidante de bajo peso molecular que juega un papel importante como cofactor de enzimas que inactivan compuestos tóxicos generados durante el metabolismo del etanol. A pesar que este resultado no se corresponde con el obtenido por Hydzik P y col en 2016 en pacientes en abstinencia alcohólica²³ sí corroboran los resultados obtenidos por nuestro grupo de trabajo en pacientes durante la Abstinencia Alcohólica,²⁴ los cuales coinciden con la afirmación realizada por Albert Y. Sun en 2001 al referir que el consumo crónico de etanol puede aumentar la formación de ERO y disminución de los mecanismos de defensa antioxidante mitocondrial.²⁵

La depleción del GSH provoca la acumulación de estas sustancias tóxicas las cuales se acumulan y promueven el daño cerebral. Las concentraciones de Nitrato/Nitrito aumentaron en las ratas en AA comparado con el grupo control. La disminución de SOD y el incremento de Nitrito/ Nitrato sugieren la generación de peroxinitrito una citotoxina bien conocida, resultados que coinciden con lo planteado por Yuksel N²⁶ en 2005. y por Tamara R en 2009 al plantear que ‹‹el estrés oxidativo resultado de la disfunción mitocondrial, excitotoxicidad, o neuroinflamación está presente en numerosas condicione degenerativas. El daño producido por el anión superóxido, el radical hidroxilo y el peroxinitrito ha sido observado en afectaciones como las enfermedades de Alzheimer, y Parkinson.››²⁷

Por cogeneración de superóxido, el NO (Óxido nítrico) es rápidamente redirigido a la formación de peroxinitrito. Siempre que existan pequeños incrementos en la producción simultánea de superóxido y NO habrá mayor estimulación de formación de peroxinitrito, un incremento 10 veces en superóxido y la producción de NO incrementará la producción de peroxinitrito 100 veces más. Como consecuencia las condiciones patológicas pueden incrementar la producción de peroxinitrito. Siempre la generación de un flujo moderado de peroxinitrito por largos períodos de tiempo resultará en una oxidación sustancial y destrucción potencial de importantes constituyentes celulares, provocando la disfunción de procesos celulares críticos, disrupción de vías de señalización, y la inducción de muerte celular a través de apoptosis y necrosis.²⁸ Estos eventos patológicos están presentes en mecanismos de excitotoxicidad asociados al daño cerebral los cuales ocurren durante la AA.

El MDA y los HT son marcadores del daño celular oxidativo. Existió un incremento en las concentraciones de MDA lo cual es representativo del daño cerebral por peroxidación lipídica. Este aldehído tiene una especial importancia en el alcoholismo y en la AA ya que el MDA es un sustrato de la Aldehído Deshidrogenada (ALD2). Esta enzima es responsable del metabolismo del Acetaldehído (inductor del daño cerebral por consumo crónico de etanol) y otros aldehídos lipídicos producidos por el metabolismo del etanol. Por lo tanto el incremento del MDA sugiere la inhibición de ALD2, que puede ser inhibida por ERO y nitrógeno29 las cuales estaban incrementadas al final de la AA. Los HT estaban disminuidos al final de la AA. Los HT son precursores de otras ERO como ácido hipocloroso, radicales hidroxilos. La disminución de HT sugiere que estos pudieron estar derivados a otras ERO.²⁹ Las enzimas SOD, CAT y GSH son antioxidantes que están presentes en el SNC donde son responsables de las funciones básicas del cerebro tanto físicas como cognitivas. Después de dos semanas de AA las ratas mostraron afectación de las funciones cerebrales como la capacidad de aprendizaje y memoria, actividad locomotora y ansiedad. Debido al estrés oxidativo inducido en el cerebro de las ratas fue importante investigar mediante los marcadores redox la existencia de alguna relación entre estos y las pruebas conductuales realizadas. Los resultados sugieren que la actividad locomotora y la memoria de las ratas después de dos semanas de AA estuvieron afectadas por las concentraciones de GSH, y por las correlaciones SOD/CAT, SOD/HT y SOD/GSH. Fueron encontradas correlaciones negativas memoria/aprendizaje. Esto significa que el incremento de estos marcadores antioxidantes disminuyen la latencia para encontrar la plataforma sumergida, mientras que la actividad locomotora (rotarod) y la hipoactividad (entrada a los brazos cerrados en 5 min) mostraron una correlación positiva, lo cual indica que el incremento de las relaciones SOD/HT (p<0,0001), SOD/CAT, SOD/GSH (p<0,0001) y las concentraciones de GSH pueden favorecer la actividad locomotora en la AA. La ansiedad es otro prominente síntoma de la AA. Los marcadores de daño oxidativo el MDA e HT mostraron correlaciones negativas con el tiempo de permanencia en los brazos abiertos lo que sugiere que la peroxidación lipídica y otros procesos oxidativos promueven el daño cerebral asociado con comportamiento ansioso en la AA. La SOD estuvo correlacionada en un 50 % con otros marcadores redox lo cual sugiere el papel del radical superóxido y la importancia de la actividad de la SOD en el daño oxidativo cerebral y en el comportamiento en la AA, en nuestras condiciones experimentales. Por otra parte, la mayoría de las correlaciones que fueron encontradas entre los marcadores redox sugiere el papel de estas interacciones en el daño cerebral después de dos semanas de AA.

Se puede decir que el estrés oxidativo provoca daño cerebral y afectaciones del comportamiento después de dos semanas de AA, en nuestras condiciones experimentales. Las correlaciones entre variables demostraron el papel de las ERO en los signos de AA asociados con aprendizaje/memoria, actividad locomotora y comportamiento ansioso. Estos resultados sugieren la posibilidad de ser considerado el Ozono médico en el tratamiento de los síntomas de AA.

CONFLICTO DE INTERESES

No declarado por los autores

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Recibido: 25 de agosto de 2016.
Aprobado: 20 de octubre de 2016.

María Teresa Díaz-Soto . Instituto de Farmacia y Alimentos, Universidad de la Habana. San Lázaro y L. La Habana, Cuba. Teléfono: +53 57948238. Correo electronico: ietd@elacm.sld.cu

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