Evaluación del desempeño del método analítico aplicable al estudio de estabilidad del albendazol 200 mg/5 mL, polvo para suspensión

Caridad Margarita García Peña; Naylin Casamayor Díaz; Yanay Montano Peguero; María Teresa Herrera Santi; Vivian Martínez Espinosa; Mirna Fernández Cervera; Juan Alberto Pérez Carrasco; Regla de las Cuevas de las Cuevas

Evaluación del desempeño del método analítico aplicable al estudio de estabilidad del albendazol 200 mg/5 mL, polvo para suspensión

ARTÍCULO ORIGINAL

Evaluación del desempeño del método analítico aplicable al estudio de estabilidad del albendazol 200 mg/5 mL, polvo para suspensión

Evaluation of the performance of the analytical method for the stability study of albendazol 200 mg/5mL in suspended powder

Caridad Margarita García Peña,^I Naylin Casamayor Díaz,^I Yanay Montano Peguero^I, María Teresa Herrera Santi,^II Vivian Martínez Espinosa,^I Mirna Fernández Cervera,^III Juan Alberto Pérez Carrasco,^IV Regla de las Cuevas de las Cuevas^I

^I Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). La Habana, Cuba.
^II Empresa Farmacéutica Roberto Escudero. La Habana, Cuba.
^III Instituto de Farmacia y Alimentos (IFAL). Universidad de La Habana, Cuba.
^IV Empresa de Producción de Biológicos "Carlos J. Finlay". La Habana, Cuba.

RESUMEN

Introducción: el albendazol es un compuesto derivado de los bencimidazoles, es un fármaco antihelmíntico de amplio espectro con demostrada actividad sistémica que presenta efecto del primer paso y se transforma en un compuesto conocido como sulfóxido de albendazol. En la Farmacopea de los Estados Unidos del 2015, aparece reportado el método analítico por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (CLAR), para la cuantificación del ingrediente farmacéutico activo (IFA) en el albendazol polvo para suspensión.
Objetivos: evaluar el desempeño del método analítico y aplicarlo en el estudio de estabilidad de la suspensión reconstituida.
Métodos: se evaluó el desempeño del mismo para el control de la calidad y el estudio de estabilidad, mediante los parámetros: especificidad, exactitud y precisión (repetibilidad, precisión intermedia). Se realizaron los estudios de estabilidad de la suspensión reconstituida a temperatura ambiente, envasados en frascos de vidrio ámbar de 75 mL de calidad hidrolítica IV, boca 28 mm, con tapas de polipropileno 28 mm.
Resultados: los resultados obtenidos en la evaluación del desempeño del método fueron adecuados. Los resultados del estudio realizados, permitieron demostrar la estabilidad del Albendazol en la suspensión reconstituida.
Conclusiones: se evidenció a través de pruebas documentales, la confiabilidad del método analítico aplicable al control de la calidad y los estudios de estabilidad del producto terminado. Se demostró la estabilidad de la suspensión reconstituida durante 30 días, almacenados a temperatura ambiente.

Palabras claves: albendazol; polvo para suspensión; Cromatografía Líquida de Alta Resolución; validación; estudio de estabilidad.

ABSTRACT

Introduction: albendazol is a bencimidazol-derived compound, a broad-spectrum anti-helminth pharmaceutical with proven systemic action and one-step effect, and changed into a compound known as albendazol sulphoxide. The US Pharmacopeia of 2015 reported the high performance liquid chromatography analytical method for the quantification of the active ingredient of suspended albendazol powder.
Objectives: to evaluate the performance of the analytical method and to apply it in the stability study of the reconstituted suspension.
Methods: the performance of the analytical method was evaluated for quality control and stability studies through the parameters: specificity, accuracy and precision (repeatability, intermediate precision. The stability studies of the reconstituted Albendazol suspension at room temperature were made; then it was poured into amber-colored glass reservoirs of 75 mL of hydrolytic quality IV, 28mm opening and 28mm polypropylene seals.
Results: the results of the evaluation were adequate. The results of the studies allowed proving the stability of Albendazol in the reconstituted suspension.
Conclusions: through documentary tests, the reliability of the analytical method applicable to the quality control and the stability studies of the final product were shown. The stability of the reconstituted suspension stored at room temperature for 30 days was demonstrated.

Keywords: albendazol; suspension powder; high performance liquid chromatography; validation; stability study.

INTRODUCCIÓN

Los parásitos intestinales, de tipos helmintos y protozoarios, han llegado a ser una de las causas de morbilidad más importantes en la población cubana. En su mayoría son transmitidos por vía oral, especialmente por la ingestión de agua y alimentos contaminados.^1,2

El albendazol, es un carbamato bencilimidazólico que presenta un amplio espectro antihelmíntico, particularmente contra nematodos gastrointestinales. Causa alteraciones degenerativas en las células del tegumento y del intestino al unirse a un sitio de unión específico de la tubulina , inhibiendo así la polimerización y ensamblaje de los microtúbulos provocando la muerte del parásito.^3,4

La empresa farmacéutica Roberto Escudero desarrolla una formulación de albendazol polvo para suspensión; para su registro y posterior comercialización se requiere de los estudios de estabilidad y para ello se hace necesario realizar la validación del método analítico a emplear para la cuantificación del IFA en el producto terminado.

En la Farmacopea de los Estados Unidos, 2015, se reporta el método analítico para la cuantificación del IFA, en el polvo para suspensión, por CLAR, al encontrarse reportado no se hace necesaria la validación exhaustiva, es decir, la evaluación del desempeño del método.⁵

La validación de los métodos analíticos garantiza la confiabilidad y reproducibilidad de los índices de calidad de las materias primas y productos terminados, lo cual contribuye notablemente al aseguramiento de la calidad, seguridad y eficiencia de los mismos.⁶ El proceso de validación debe efectuarse antes de aplicar el método en los estudios de estabilidad. Una vez validado el método, y demostrado su especificidad frente a los productos de degradación, puede aplicarse en los estudios de estabilidad.

Los estudios de estabilidad son de vital importancia para el registro de un medicamento, ya que los mismos permiten establecer el período de validez en el envase que se pretende comercializar y en las condiciones de almacenamiento especificadas.⁷

Los objetivos de este trabajo fueron validar el método analítico, por CLAR, para el control de la calidad y estudio de estabilidad del albendazol 200 mg/5mL, polvo para suspensión y estudiar la estabilidad de la suspensión reconstituida.

MÉTODOS

La sustancia de referencia química de albendazol, lote No. 15001, fue suministrada por el Departamento de Materiales de Referencia del Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM), con una pureza de un 99,7 %. La muestra de albendazol 200 mg/5 mL polvo para suspensión empleada en el estudio de validación correspondió al lote 15002, fabricada en la empresa Roberto Escudero, el cual cumplió con las especificaciones de calidad establecidas para el control de la calidad del producto terminado.

Todos los reactivos utilizados fueron de calidad analítica, procedentes de la Riedel de Haen, España.

MÉTODO PARA LA CUANTIFICACIÓN DEL IFA EN EL PRODUCTO TERMINADO

Para la determinación del IFA en el producto terminado se empleó la Cromatografía Líquida de Alta Resolución, utilizando un cromatógrafo KNAUER con detector UV/VIS ajustado a 308 nm, un dosificador (Loop) de 20 µL e integrador SHIMADZU CR 8 A. La separación se realizó isocráticamente sobre una columna Lichrocart RP-18 empacado con tamaño de partícula de 5 µm (4 mmx25 cm). La fase móvil consistió en una mezcla desgasificada de metanol:solución de fosfato de sodio monobásico (11,0 g en 800 mL de agua destilada) (70:30); con una velocidad de flujo de 2,0 mL/min.⁵

La sustancia de referencia química y las muestras fueron preparadas según la metodología establecida en la Farmacopea de los Estados Unidos (USP 37, 2015).⁵

Para el estudio de validación se evaluaron los siguientes parámetros:

Especificidad del método: se analizó la sustancia de referencia química de albendazol; el placebo; la muestra y muestras sometidas a condiciones drásticas tales como hidrólisis ácida (HCL 1N), hidrólisis básica (NaOH 1 N), oxidación, luz natural y temperatura. Las muestras de análisis permanecieron degradándose durante 3 días. Las muestras sometidas a condiciones de hidrólisis ácidas y básicas fueron neutralizadas en la segunda dilución antes de ser inyectadas en el cromatógrafo, y las muestras iniciales continuaron degradándose durante siete días más, manteniendo la degradación durante 10 días.

Criterios de respuesta: no se debe obtener señales del placebo, ni de los productos de degradación en la zona de elusión del ingrediente activo.^5,6,8-10

Precisión del método: se evaluó a través de los estudios de repetibilidad y precisión intermedia. La repetibilidad se estudió sobre la base de 10 determinaciones. Se determinaron los valores medios, la desviación estándar y el coeficiente de variación.

En el estudio de precisión intermedia participaron dos analistas, en dos días diferentes, en el mismo laboratorio. Se analizaron diez réplicas en cada caso de muestras equivalentes al 100 %. La prueba de Fisher se utilizó para determinar si existían diferencias significativas entre los resultados de los analistas que emplearon el mismo método y entre los días en que se realizaron los análisis. La prueba t de Student se utilizó para comprobar si los valores medios obtenidos entre los analistas, que emplearon igual método, y los dos días en que se realizaron los análisis, eran homogéneos, para un nivel de confianza del 95 %.

Criterios de respuesta: repetibilidad (CV≤2,0); precisión intermedia (t calculada debe ser menor t tabulada; F calculada debe ser menor F tabulada), para un nivel de confianza de 95 %.^5,6,8-10

Exactitud del método: se empleó el método de recuperación, preparando muestras con diferentes niveles de la concentración teórica del ingrediente farmacéutico activo en la solución: bajo, medio y alto correspondiente con el 80, 100 y 120 %, respectivamente.

Criterios de respuesta: recuperación media entre un 98,0-102,0 %, la G calculada debe ser menor que G tabulada para un nivel de confianza de 95 %.^5,6,8-10

ESTUDIO DE ESTABILIDAD DE LA SUSPENSIÓN RECONSTITUIDA

Se realizó a temperatura ambiente (30±2 ^oC), por un período de 1 mes, analizándose las muestras al inicio, a los 7, 14, 21 y 30 días. Se emplearon muestras de los lotes 15001, 15002 y 15003, envasadas en frascos de vidrio ámbar de 75 mL de calidad hidrolítica IV, boca 28 mm, con tapas de polipropileno 28 mm.

Los parámetros analíticos analizados⁷fueron las características organolépticas, suspendibilidad, resuspendibilidad, identificación, valoración y conteo microbiológico, se realizaron según la metodología descrita en el Farmacopea de los Estados Unidos (USP 37, 2015).⁵

La identificación se realizó solo al inicio y el resto de los parámetros se evaluaron en todos los tiempos.

RESULTADOS

VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO

Especificidad: en la figura 1, se reportan los cromatogramas correspondientes al placebo, la sustancia de referencia química y la muestra; mientras que en la figura 2, se reflejan los cromatogramas de las muestras sometidas a condiciones de degradaciones drásticas, así como las vías de formación de los productos de degradación del albendazol en cada medio degradante empleado.

Precisión: en el estudio de la repetibilidad realizado a una misma muestra, por el mismo analista, el mismo día, a través de diez réplicas, se alcanzó un coeficiente de variación adecuado (0,42 %), lo que demuestra la buena precisión del método según el límite para los métodos cromatográficos CV≤2,0 %. Estos resultados aparecen en la tabla 1.

Exactitud: en la tabla 2, se muestran los resultados obtenidos en el análisis de la exactitud del método.

ESTUDIO DE ESTABILIDAD DE LA SUSPENSIÓN RECONSTITUIDA

En la tabla 3, se presentan los resultados obtenidos en el estudio de estabilidad de la suspensión reconstituida.

DISCUSIÓN

VALIDACIÓN DEL MÉTODO PARA LA CUANTIFICACIÓN DEL IFA EN EL PRODUCTO TERMINADO

Especificidad: se analizó la sustancia de referencia química de albendazol, el placebo, la muestra de producto terminado albendazol 200 mg/5 mL polvo para suspensión y las muestras sometida a condiciones drásticas.

Las degradaciones aceleradas en condiciones drásticas permiten dilucidar la estabilidad intrínseca de un analito y forman parte de la estrategia a seguir para determinar los productos de degradación de un fármaco.

Los resultados obtenidos en la figura 1, demuestran la especificidad del método para ser aplicado al control de la calidad por no presentarse interferencias de picos adicionales en el cromatograma (A), correspondiente al placebo, en la determinación del principio activo. Al analizar la sustancia de referencia química y la muestra de producto terminado en las mismas condiciones cromatográficas, la sustancia de referencia química de albendazol preparada al 100 % y la muestra de producto terminado albendazol polvo para suspensión, presentan señales en el mismo tiempo de retención de 6,6 minutos.

Se observa también que la respuesta analítica del placebo no interfiere en la respuesta obtenida de los cromatogramas en los productos de degradación, donde tampoco se observaron posibles productos de degradación de los excipientes. Con lo cual se puede afirmar la adecuada especificidad del método para el control de la calidad.

Los resultados obtenidos al someter la muestra a condiciones drásticas, durante tres días, evidenciaron una disminución del pico del albendazol en los cromatogramas correspondientes a las muestras sometidas a hidrólisis ácida y básica, sin evidenciarse la aparición de picos de degradación, razón por la cual se decidió continuar el estudio de especificidad durante 10 días. Mientras que en las muestras sometidas a temperatura y luz, no se observaron picos adicionales y la disminución del pico, no resultó significativa. Sin embargo, la muestra sometida a condiciones de oxidación, se evidenció en el cromatograma, una disminución significativa observándose picos adicionales atribuibles a los productos de degradación del albendazol, los cuales fueron observados en los cromatogramas obtenidos en el ingrediente farmacéutico activo tratado en iguales condiciones, no observándose en el cromatograma de la muestra placebo, estos resultados coinciden con lo planteado por Rodríguez, en el 2012 y por Sun-Kou, en el 2013, acerca de la facilidad de oxidación del albendazol.^11,12

En la figura 2, se reflejan los cromatogramas correspondientes a la hidrólisis ácida, básica y oxidación, a los 3 y 10 días, así como las vías de obtención de los productos de degradación del albendazol, que justifican los resultados obtenidos.

El albendazol en medio de hidrólisis ácida puede sufrir dos reacciones, por el grupo éster y por el grupo amida, la primera puede ser reversible, mientras que la segunda es irreversible. En hidrólisis básica puede reaccionar reversiblemente por el grupo éster; mientras que en medio de oxidación puede sufrir degradación por el grupos.

Los cromatogramas de las muestras sometidas a condiciones drásticas, demuestran que los productos de degradación no interfieren en la determinación del IFA, porque no eluyen al mismo tiempo de retención del albendazol, observándose la disminución de la señal correspondiente al albendazol y la aparición de picos secundarios a otros tiempos de retención (tr).

Según lo establecido por nuestro órgano regulador, el Centro Estatal para el Control de Medicamentos y Equipos Médicos (CECMED), en las Buenas Prácticas para Laboratorio de Control de Medicamentos, en el Anexo I Sobre Validación de Métodos Analíticos, el procedimiento empleado para el tratamiento de las muestras resultó efectivo, ya que se observaron evidencias de degradación del IFA, a partir de una disminución significativa del área bajo la curva del pico de más de un 15 % para las condiciones drásticas ensayadas, al ser comparados con la muestra sin degradar, preparadas a concentraciones similares y analizados por el mismo método analítico; así como la aparición de los productos de degradación del albendazol.

Los resultados obtenidos con este método coincidieron con lo planteado por Rodríguez, en el 2012, ya que las condiciones en las cuales se obtuvieron señales atribuibles a los productos de degradación fueron la hidrólisis catalizada en medio básico, mientras que en la degradación por hidrólisis ácida, luz y temperatura, se evidenció una disminución del pico atribuible al pico del albendazol.¹¹

De esta forma se demuestra la especificidad del método analítico para el control de la calidad y el estudio de estabilidad del albendazol polvo para suspensión, ya que no se evidenciaron interferencias de los excipientes de la formulación, ni de los productos de degradación del albendazol.⁶

Precisión: con la repetibilidad se alcanza un coeficiente de variación adecuado lo que demuestra la buena precisión del método según el límite para los métodos cromatográficos CV≤2,0 %.

Los valores que se obtienen de las pruebas de Fischer y t de Student, para el estudio de la precisión intermedia demuestran que no existen diferencias significativas entre las determinaciones alcanzadas por los analistas en diferentes días para una probabilidad de 0,05 %, ya que el valor de F calculada es menor que la F tabulada. Al realizar la prueba de t de Student el valor calculado resulta ser menor que el tabulado para una probabilidad de 0,05, lo cual demuestra que no existen diferencias significativas entre las medias obtenidas, con un nivel de significación de un 5,0 %.^5,6,8-10

Exactitud: en la influencia del factor concentración sobre la variabilidad de los resultados de la exactitud al aplicar la prueba de Cochran se obtuvo que la G calculada fue menor que la G tabulada para una probabilidad de 0,05, k=3 y n=3; por lo tanto, las varianzas de las concentraciones empleadas son equivalentes indicando que la concentración no influye en la variabilidad de estos. Al realizar la prueba de significación entre la recuperación media y el 100 % de recuperación, con un coeficiente de variación de 0,05 %, se obtuvo una t calculada menor que la t tabulada. En el rango seleccionado en el estudio de exactitud, los valores de porciento de recobro están dentro de los límites establecidos para los métodos cromatográficos (98,0-102,0 %) y los valores del coeficiente de variación, para cada uno de los niveles de concentración estudiados, fueron menores que el 2,0 %.^5,6,8-10

ESTUDIO DE ESTABILIDAD DE LA SUSPENSIÓN RECONSTITUIDA

Los resultados obtenidos en el estudio de estabilidad de la suspensión reconstituida, teniendo en cuenta que para la cuantificación del contenido en porciento del albendazol se empleó el método analítico por CLAR validado anteriormente. Los resultados mostrados son la media de las tres réplicas realizadas en cada tiempo y a cada lote, demostraron la estabilidad de la suspensión reconstituida ya que después de transcurridos 30 días mantuvo la concentración conforme con los límites establecidos en las especificaciones de calidad del producto terminado y la disminución fue inferior al 5 %. No se observaron cambios significativos, en las características organolépticas, suspendibilidad, resuspendibilidad, ni en el pH. No se observan los productos de degradación, en los tiempos evaluados (inicio, 7, 14, 21 y 30 días), ya que en los cromatogramas obtenidos durante el período evaluado, solo se reportan señales atribuibles al IFA.

El conteo microbiano realizado en cada tiempo y en cada lote, cumple con los criterios establecidos para el producto terminado de producción nacional.

Se comprobó la estabilidad física, química y microbiológica de la suspensión reconstituida de albendazol durante 30 días, almacenada a temperatura ambiente (30±2 ^oC, 70±5 % de humedad relativa), envasada en frascos de vidrio ámbar de 75 mL de calidad hidrolítica IV, boca 28 mm, con tapas de polipropileno 28 mm.⁷

El método analítico evaluado para el albendazol polvo para suspensión, por Cromatografía Líquida de Alta Resolución, resultó específico, preciso y exacto, en el rango de concentraciones estudiadas, de igual forma la suspensión reconstituida de albendazol, resultó estable durante 30 días, almacenada a temperatura ambiente.

CONFLICTO DE INTERESES

No declarado por los autores

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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6. Cecmed. Buenas Prácticas para Laboratorio de Control de Medicamentos. Anexo I: Validación de Métodos Analíticos. La Habana:Centro Estatal para el Control de Medicamentos (CECMED); 2013:3-25.

7. Cecmed. Regulación 23 -2000. Requerimientos de los estudios de estabilidad para el registro de productos farmacéuticos. La Habana:Centro Estatal para el Control de Medicamentos (CECMED); 2000.

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10. Chan CC, Lam H, Lee YC, Zhang X. Analytical Method Validation and Instrument Performance Verification. Hoboken. NJ: John Wiley & Sons, Inc; 2004.

11. Rodríguez J, Díaz I, Gil J, Fusté V. Estabilidad de una formulación cubana de albendazol tabletas. Revista Cubana de Farmacia. 2012;46 (4). [citado Julio 2014]. Disponible en: http://scielo.sld.cu/pdf/far/v46n4/far04412.pdf

12. Sun-Kou M, Vega E, Picasso G. Oxidación catalítica de albendazol empleando como catalizador Molibdeno soportado en nanotubos de carbono. Revista de la Sociedad Química de Perú. 2013;79(4):291-303.

Recibido: 29 de septiembre de 2016.
Aprobado: 30 de noviembre de 2016.

Caridad Margarita García Peña . Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). Ave 26 No. 1605 e/ Boyeros y Puentes Grandes. Plaza de la Revolución. La Habana, Cuba. Correo electrónico:caridadgp@infomed.sld.cu; caridad.garcia@cidem.cu

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