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ARTÍCULO ORIGINAL
Desarrollo y validación de un método analítico rápido para la determinación cuantitativa de cefalotina sódica libre en plasma sanguíneo
Development and validation of a fast analytical method for determination of unbound sodium cephalothin in human plasma
Jairo Mercado-Camargo, Shirley Cavadia-Puello, Meira Sanjuán-Blanco, Eduardo Morales-Julio
Grupo de Investigación en Química de Medicamentos, Laboratorio de Análisis de Medicamento (LAM). Campus de Zaragocilla. Facultad de Ciencias Farmacéuticas. Universidad de Cartagena. Colombia.
RESUMEN
Introducción: un rápido y sensible
método de cromatografía liquida de alta resolución con detector
de arreglo de diodo fue desarrollado y validado para la determinación rutinaria
de cefalotina sódica libre en plasma. La etapa de preparación se basa
en la precipitación de proteínas de plasma con acetonitrilo seguido
de la evaporación del sobrenadante, la muestra se reconstituyo con fase
móvil antes de la inyección. Esta metodología validada fue utilizada
en el laboratorio para monitorización de la droga en pacientes postoperatorio.
Objetivo: diseñar y validar un método
de cromatografía líquida de alta resolución para cuantificar
cefalotina sódicaen plasma humano.
Métodos: el desarrollo y validación se llevó a cabo empleando
una columna RP-18 de 150 × 4,6 mm, 5 µm; fase móvil: tampón
fosfato pH 5,0 y acetonitrilo (75:25); flujo: 1,5 mL/min y un detector de arreglo
de diodo a una longitud de onda de 280 nm y temperatura de 25 °C.
Se calcularon los límites de detección y cuantificación y se
evaluaron las posibles interferencias.
Resultados: como mejor agente precipitante de las proteínas extrayente
de la cefalotina sódica en plasma fue el acetonitrilo con un volumen de
carga de 6 % como máximo. El método fue lineal (r= 0,9989), exacto
(porcentaje de recuperación de 97,6 % ± 0,8, preciso (RSD< 15,0
%), sensible y robusto al variar las condiciones analíticas.
Conclusiones: el método desarrollado y validado resultó lineal,
preciso y exacto en el intervalo de concentraciones analizado (5 hasta 500 µg/mL),
lo que permitió la determinación la cefalotina sódica en plasma
sanguíneo.
Palabras clave: cefalotina sódica; plasma; cromatografía líquida de alta resolución; validación.
ABSTRACT
Introduction: A fast sensitive method
of high resolution liquid chromatography with diode array detector was developed
and validated for routine determination of unbound sodium cephalothin in plasma.
The preparation stage was based on plasma protein precipitation with acetonitrile
followed by supernatant evaporation, and sample was restructured with mobile
phase prior to injection. This validated methodology has been used in the laboratory
to monitor drug amount in postoperative patients.
Objective: To design and validate a high performance liquid chromatography
method to quantify sodium cephalothin in human plasma.
Methods: Development and validation was carried out by using a RP-18
150 × 4,6 mm column, 5 µm; mobile phase: pH 5.0 phosphate buffer
and acetonitrile (75:25); 1,5 mL/min flow and a diode array detector was used
at a 280 nm wavelength and at 25 °C. The detection and quantitation limits
were calculated, and the possible interference was evaluated.
Results: The best e precipitating agent of cephalothin sodium extracting
proteins in plasma was acetonitrile with a maximum load volume of 6 %. The method
was linear (r= 0.9989), exact (recovery rate 97.6 % ± 0.8, precise (RSD
< 15.0 %), sensitive and robust when analytical conditions change.
Conclusions: The developed and validated method is linear, accurate and
precise in the range of tested concentrations, which allows determining cephalothin
sodium in blood plasma.
Keywords: Cephalothin sodium; plasma; high performance liquid chromatography; validation.
INTRODUCCIÓN
De las infecciones nosocomiales, las posquirúrgicas son las más comunes y una de las complicaciones más frecuentes con las que se enfrenta un cirujano. La profilaxis con antibióticos en cirugía está definida como la acción de prevenir infecciones en un sistema de riesgo calculado o conocido estadísticamente, en donde no existe evidencia clínica o paraclínica de las mismas antes del procedimiento quirúrgico.1
Numerosos estudios reportan buenos resultados con el empleo profiláctico de antibióticos para prevenir la infección postoperatoria. Su utilidad no se discute, es una práctica habitual y estándar. Cuando estos no son utilizados, la frecuencia de infecciones en el sitio operatorio y a distancia se eleva hasta un 87 %, por ello, la profilaxis antibiótica perioperatoria se puede considerar como un indicador de calidad asistencial, al disminuir la incidencia de infecciones y el costo de una infección intrahospitalaria con prolongado internamiento.2 Los agentes antimicrobianos y profilácticos deben ser efectivos en contra de los organismos comunes que ocasionan infecciones de las heridas después de un procedimiento quirúrgico específico. Deben estar presentes concentraciones adecuadas del medicamento en los tejidos al inicio y a los largo de toda la cirugía.
Las cefalosporinas de primera generación incluyen cefalotina, cefapirina, cefradina y cefazolina; sumado a esto características como su amplio espectro, capacidad de penetración tisular, elevada vida media y mínima toxicidad confirman el uso de cefalosporinas como agentes de elección para la profilaxis. Son activas contra Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis y Streptococcus spp., siendo estos los organismos que más comúnmente ocasionan infecciones de heridas quirúrgicas. Sin embargo, por la diversidad e influencia de numerosos factores, para la mayoría de los procederes quirúrgicos el fármaco adecuado y el número de dosis necesarias para una cobertura óptima no están bien definidos.1,2
La determinación de las concentraciones adecuadas de los fármacos para ejercer su efecto terapéutico, es un tema de gran interés, en donde la mayoría de los investigadores utilizan la farmacocinética clínica.
El tema de la concentración plasmática alcanzada, después de la administración de una dosis, se agrava con fármacos antimicrobianos, ya que el uso de concentraciones inferiores a las requeridas, podría generar resistencia bacteriana, lo cual disminuye la actividad de estos.
Mientras que con el uso de concentraciones superiores se inhibe el desarrollo de microorganismos con relativa facilidad, pero se expone al paciente a reacciones adversas más severas, que en su mayoría son dosis dependiente, lo cual puede generar posibles intoxicaciones.3
La cefalotina es una cefalosporina de primera generación, que resulta de las modificaciones del modelo principal de las cefalosporinas, el cual está compuesto por un anillo de dihidrotiazina unido a un anillo betalactámico. Esta es la más antigua de las cefalosporinas parenterales. Por no poseer una buena absorción vía oral, se administra por las vías intramuscular e intravenosa.4,5
Un número importante de métodos por cromatografía líquida (LC) se han publicado para la determinación de cefalosporina en plasma o plasma humano. La aplicación en LC-MSMS resulta muy atractiva, por ser un método de cuantificación de cantidades trazas de este tipo de drogas. Sin embargo, debido a sus concentraciones relativamente alta (µg/mL) en el plasma, las cefalosporinas se pueden medir fácilmente con los detectoressmás popular y baratos: como los detectores UV.6,7 Por otro lado, dado que los ensayos de monitoreo de fármacos publicados en diversas referencias para el seguimiento terapéutico de drogas betalactámicos miden las concentraciones totales de antibióticos, estimar con precisión la concentración de antibiótico no unido puede ser difícil. Esto se agrava en pacientes en estado crítico por las frecuentes uniones a proteínas de antibióticos tales como ceftriaxona, cefazolina, ertapenem, flucloxacilina y dicloxacilina.8
El presente trabajo tiene como finalidad diseñar una metodología económica y rápida que permita la cuantificación de cefalotina sódica en plasma para contribuir al desarrollo del servicio de análisis de medicamentosprestado en diferentes centros hospitalarios de la ciudad.
MÉTODOS
La cefalotina sódica utilizada fue estándar primario USP (número de catálogo 1102000, United States Pharmacopeia).
REACTIVOS
El metanol y acetonitrilo fueron grado cromatográfico (Merck, Darmstadt, Alemania), el ácido tricloroacético fue grado analítico (Merck, Darmstadt, Alemania), el agua utilizada fue grado Milli Q y filtrada a través de membranas de 0,45 µm. La muestra de plasma sanguíneo libre de droga fue adquirida del banco de sangre de la Cruz Roja Colombiana-seccional Bolívar, almacenada en tubos de polipropileno a -20 °C hasta la utilización en el análisis. Los demás reactivos fueron grado analítico.
INSTRUMENTACIÓN
El método fue desarrollado, validado y operado en un cromatógrafo líquido modular LaChrom Elite® (Hitachi), equipado con una bomba cuaternaria (L-2130), Automuestreador (L-2200) y con Detector de Arreglo de Diodo (L-2455). Los ensayos fueron llevados a cabo en una columna Luna® RP-C18e de 150 × 4,6 mm y tamaño de partícula 5 µm (Phenomenex, California, USA) mantenida a 25 °C. La fase móvil inicialmente fue de acetonitrilo y Buffer Fosfato en proporción 25:75 v/v.
PARTE EXPERIMENTAL
Preparación de la Solución stock y la Solución de trabajo: la solución stock de cefalotina sódica fue preparada en agua a una concentración de 1 000 µg/mL. Las soluciones de trabajo fueron diluidas en plasma libre de medicamento a fin de obtener una curva de calibración en el rango de trabajo de 5-500 µg/mL (n= 6). Todas las soluciones fueron almacenadas a −20 °C. La curva de calibración y las muestras de control de calidad de 5,0; 50,1; 100,2 y 200,0 µg/mL (baja, media y alta respectivamente) que contenía la molécula en estudio fueron diluidas en plasma libre de medicamento.
Desarrollo del método: se examinaron varios parámetros para determinar las mejores condiciones de separación. Se estudió el pH de la fase móvil en el rango de 3,0 a 6,0. También fueron evaluados varios agentes precipitantes de proteínas (metanol, acetonitrilo y ácido tricloroacético), así como su volumen de carga del solvente orgánico (entre 4 % y 10 %) en la muestra y las concentraciones del buffer fosfato en la fase móvil (de 50 mmol/L hasta 100 mmol/L).
Preparación de la muestra: una alícuota de 200 µL de plasma obtenido de la muestra de sangre, fue transferida a un tubo Eppendorf de 1,5 mL con 600 µL de acetonitrilo para la precipitación de las proteínas. La solución se agitó en un vortex durante 30 seg, luego se centrifugó (Centrifuga Labnet serie L305034) por 10 min a 1 500 rpm. El sobrenadante obtenido fue diluido con la adición de 10 mL de agua Milli Q. La solución anterior fue cargada en cartuchos de extracción en fase sólida Strata C18e (Phenomenex, California, USA) previa adecuación con 2 mL de metanol y 2 mL de agua, después la muestra fue cargada en el cartucho y lavada con dos volúmenes de metanol. Finalmente, la elución fue realizada con 2 mL de Tampón fosfato:acetonitrilo, 25:75 (v/v %). El resultado de la elusión se depositó en viales de 1,5 mL para su posterior lectura en el cromatógrafo líquido.9
VALIDACIÓN
La idoneidad del sistema se comprobó a través de seis inyecciones analizadas en las condiciones cromatográficas propuestas.
Los parámetros de validación del método propuesto (linealidad, exactitud, precisión, selectividad y robustez), se evaluados de acuerdo a la directriz ICH Q2(R1) (International Conference on Harmonisation).10
Linealidad: los experimentos se llevaron a cabo mediante el análisis de disoluciones estándar de cefalotina sódica preparada en plasmasanguíneolibre de medicamento enriquecidas en concentraciones nominales entre 5 a 500 µg/L (n= 6). La curva de calibración fue generada por el método de los mínimos cuadrados de regresión lineal del área del pico del analito frente a la concentración nominal. La desviación porcentual con respecto al nominal se calculó para cada concentración de serie con ≤10 % como criterio de aceptación para su inclusión en la curva de calibración.10
Los parámetros límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ) se estimaron a partir de la curva de regresión. Los LOD y LOQ fueron calculados según la guía ICH.9
Exactitud: se determinó preparando tres muestras en plasma libre de medicamento a cuatro niveles de concentración (5,0;50,1; 100,2 y 200,0 μg/L respectivamente), comparados contra la concentración nominal de muestras control y expresadas como el porcentaje de recuperación. Criterio de aceptación: RSD ≤15,0 %.
PRECISIÓN
El ensayo de precisión se investigó con respecto a la repetitividad (intra-día) y la precisión intermedia (inter-día). La repetitividad se evaluó mediante el ensayo de nueve réplicas, durante el mismo día y bajo lasmismas condiciones experimentales. La precisión intermedia se evaluó mediante la realización del análisis en tres días diferentes y tres analistas diferentes. La precisión se expresó cómo RSD. Criterio de aceptación: RSD ≤ 15 %.11
Robustez: la robustez del método se determinó realizando pequeñas variaciones deliberadas en los parámetros del método tales como la velocidad de flujo (1,0 y 1,5 mL/min), la concentración del buffer (100 mmol/L- 150 mmol/L) de la fase móvil y la longitud de onda (260-273b nm). Se cambiaron simultáneamente todos los parámetros y para todos los cambios el análisis se realizó por triplicado. Para el análisis estadístico de los resultados de la robustez se aplicó ANOVA.12,13
Selectividad: se utilizaron siete muestras de plasma sanguíneo libre de droga procedentes de voluntarios sanos. Además fueron utilizadas muestras contaminadas con el estándar y productos de degradación de la cefalotina sódica, a las cuales se les realizo el procedimiento de extraccióndescrito con anterioridad y se sometieron al análisis cromatográfico.
RESULTADOS
Se evaluó el comportamiento de diferentes agentes precipitantes (metanol, acetonitrilo y ácido tricloroacético) de proteínas con el objetivo de elegir el que brindara el mejor comportamiento para el desarrollo del presente análisis. Se estableció trabajar con el acetonitrilo con un volumen de carga de 600 µL correspondiente al 6 % por lograr precipitar las proteínas del plasma y solubilizar la cefalotina sódica de manera eficaz, obteniendo una mayor área bajo la curva (3 9204 48,3 ± 5071,3 para el acetonitrilo) que con los otros agentes evaluados.
Partiendo de las condiciones reportadas por McWhinney y colaboradores 2010,14 se evaluó la influencia de la composición de la fase móvil en las condiciones cromatográficas. Los mejores resultados cromatográficos se lograron con la fase móvil constituida por una combinación de acetonitrilo con buffer fosfato 150 mmol/L en una proporción de 25:75 (% v/v), ajustado a un pH de 5,0; un flujo de 1,5 mL/min y 25 °C de temperatura. El tiempo de retención para la cefalotina sódica en las condiciones evaluadas fue de 2,8 ± 1,1 min, por lo cual fue considerado como adecuado para el desarrollo del análisis. Los resultados de la idoneidad del sistema se muestran en la tabla 1, los cuales dieron un cumplimiento satisfactorio de todos los criterios de aceptación.
De acuerdo al análisis independiente realizado a las muestras de plasma
sanguíneo de siete voluntarios, no se observó ningún pico endógeno
y ninguna respuesta en el tiempo de retención al cual eluyó la cefalotina
(Fig.). En los cromatográmas se puede notar
que no hay solapamiento de ningún pico cuando se le adiciona una cantidad
de cefalotina a estas muestras (10 µg/mL).
La curva de calibración construida para la cefalotina sódica presentó una buena linealidad en el rango de concentración de 5,0 a 500,0 µg/L (n= 6) (y= 4410,2x - 21615) mostrando elevados coeficientes de correlación y determinación (tabla 2). Se puede apreciar que los valores experimentales de t para el intercepto es menor que el valor tabulado, demostrando que el intercepto en la curvas de calibración no es significativamente diferente de cero. Con respecto a la pendiente se encuentra el valor experimental de t mayor al tabulado, indicando con esto que la pendiente es significativamente diferentes de cero (p< 0,05). El análisis de varianza mostró que el modelo fue adecuado para la representación de los datos (p< 0,0001). Se comprobó la significación del intercepto con respecto al cero a través de la prueba de Student. El intercepto de recta de ajuste está cercano a cero, al aplicársele la prueba t de Student se obtuvo un valor de t experimental (texp= -1,357) menor que el valor de t tabulado, (ttab= 2,78) para una probabilidad del 95, lo que permitió establecer que no existen diferenciasestadísticamente significativas.
Los límites de detección (LOD) y de cuantificación (LOQ) fueron 0,5 ± 1,9 µg/L y 1,08 ± 2,5 µg/L respectivamente.
Los porcentajesde recuperación de cefalotina
sódica se muestran en la tabla 3, donde se observa
que el recobro promedio fue de 98,6 % ± 1,1 con un RSD de 2,2 %; en el
intervalo de confianza de 96,6 % a 101,4 %. La precisión fue satisfactoria
tanto intra- como inter- día, y los valores de RSD estuvieron en el intervalo
0,2 % a 1,3 %, lo cual está por debajo de lo reportado (tabla
4).15
El ensayo de robustez mostró que no existió una disminución en
de las área bajo las curvas cuando se sometió el analito a las variaciones
realizadas (p< 0,05); lo cual indicó que no se ven afectada las variables
cambiadas deliberadamente (tabla 5).
DISCUSIÓN
El uso de acetonitrilo a una concentración no mayor al 6 %, permitió al mismo tiempo precipitar las proteínas y solubilizar eficientemente la cefalotina obteniéndose mejores resultados en cuanto a recuperación del analito, siendo el acetonitrilo el mejor precipitante y solubilizante de los tres solventes probados.
En cuanto a la idoneidad del sistema después de haber desarrollado el método, el promedio para los platos teóricos calculado fue de 2679,3 ± 28,0 indicando que la eficacia de la columna que se empleó durante el estudio que esta de acuerdo al criterio establecido. De igual manera, en la misma tabla 1 los parámetros de resolución, factor de asimetría cumplieron con los criterios establecidos.
El sistema tuvo un comportamiento lineal en el intervalo de 5 a 500 µg/L, ya que se cumplieron todos los criterios estadísticos establecidos al procesar los resultados por regresión lineal. Se obtuvo una elevada proporcionalidad entre la respuesta obtenida y la concentración del analito. Dado que la p< 0,05 en la ANOVA realizada, existió relación estadísticamente significativa entre área y concentración para un nivel de confianza del 95 %.
El porcentajemedio de recuperación fue de 97,6 ± 0,8 %, por lo que el método puede considerarse exacto. Además el porciento RSD total estuvo entre el nivel aceptación establecido.
En la pruebas de precisión inter e intra-día, se obtuvieron RSD para el método, inferiores en todos los casos al 15 % establecido como límite.
En cuanto a la robustez, la composición de la fase móvil, el caudal, tiempo de equilibrio de la columna con la fase móvil, el pH, velocidad de flujo, temperatura y longitud de onda del sistema tuvieron poca o ninguna influencia en la variabilidad de los resultados, cuando se toman valores alternativos en el cambio de las variables estudiadas, puesto que la probabilidad estadística de la prueba de Fisher fue inferior a p< 0,05. El conjunto de estos resultados sugiere que pequeñas variaciones en las condiciones normales de operación no afectaron significativamente la precisión y exactitud del método desarrollado, siendo suficientemente robusto.
Este método posee una serie de características ventajosas para aplicación dentrodel laboratorio en el monitoreo de este tipo de antibióticos en plasma sanguíneo. El más notable de ellos es la capacidad de acceder a una gama de análisis con una plataforma simple y barata.
La instrumentación analítica es relativamente común en comparación con la detección por espectrometría de masas o los más nuevos sistemas de ultra cromatografía líquida de alta eficiencia. El detector de arreglo de fotodiodos usado tiene ventaja, ya que se puede calcular la pureza de pico y las características espectrales. En los parámetros de linealidad, precisión y exactitud del método las variaciones se encuentran dentro de los límites establecidos lo que confirma la validez del método para la determinación de este tipo de fármaco en muestras de plasma libre de interferencias de los componentes endógenos de la matriz.16
Partiendo de los resultados logrados durante el desarrollo y validación, el método cumple con los objetivos perfilados ya que se logró estandarizar y desarrollar los parámetros a utilizar en la determinación y cuantificación de cefalotina sódica libre en plasma sanguíneo, siendo selectivo, sensible, exacto y lineal en el rango de 5 a 500 µg/L. Así mismo, el método demostró ser robusto al momento de variar factores como la longitud de onda, flujo, composición de la fase móvil, tiempo de equilibrio de la columna y tiempo transcurrido desde la preparación y la inyección, parámetros que se debieron tener bajo control al momento del desarrollo de la metodología.
Conflictos
de intereses
Los autores declaran no presentar conflicto de intereses.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFÍAS
1. Vargas-Mena R, Arredondo-Gómez E, Pavía-Carrillo EF. Efecto de un esquema corto de profilaxis antimicrobiana sobre la prevalencia de infecciones postoperatorias en cirugía electiva de traumatología y ortopedia. Acta Ortopédica Mexicana. 2012;26(6):369-74.
2. Calzadilla V. Análisis del costo-efectividad de la profilaxis perioperatoria con cefalosporinas en cirugía ortopédica y traumatológica. Rev Cubana Med Mil 2007 [citado 10 abr 2014];36(1):[aprox. 13 p.]. Disponible en: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0138-655720070001000063. Martínez J. Comparaciones de concentraciones mínimas inhibitorias y concentraciones plasmáticas de cefalotina mediante un modelo matemático. Revista Cubana de Farmacia. 2013;47(2):213-24.
4. Chang Y. Determination of unbound cephalothin in rat blood by on-line microdialysis and microbore liquid chromatography. Journal of chromatography B. 2000;742(2000):125-30.
5. Bustos A. Cefalosporinas parenterales. Revista de enfermedades infecciosas en pediatría. 2012;25(99):109-13.
6. Ohmori T, Suzuki A, Niwa T, Ushikoshi H, Shirai K, Yoshida S, et al. Simultaneous determination of eight-lactam antibiotics in human serum by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Chromatogr. B 879(2011):1038.
7. Kunicki PK, Wás J. Simple HPLC method for cefazolin determination in human serum-validation and stability testing. Journal of Chromatography B, 2012 Dec 911(2012):133-9.
8. Briscoea SE, McWhinneya BC, Lipmanb J, Robertsb JA, Ungerera JPJ. A method for determining the free (unbound) concentration of ten beta-lactam antibiotics in human plasma using high performance liquid chromatography with ultraviolet detection. Journal of Chromatography B. 2012;907(2012):178-84.
9. Pérez R. Quechers methodologies as an alternative to solid phase extraction (SPE) for thedetermination and characterization of residues of cephalosporins in beef muscleusing LC-MS/MS. Journal of Chromatography B. 2012;899:57-65.
10. The International Conference on Harmonisation (ICH). ICH-Harmonised tripartite Guideline. Validation of analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1). ICH Expert Working Group; 2005 [cited 2014 abr 10]. Available from: https://pacificbiolabs.com/wp-content/uploads/2017/12/Q2_R1__Guideline-4.pdf
11. European Medicine Agency (EMA). Guideline on bioanalytical method validation. London: Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP); 2011.
12. Araujo P. Key aspects of analytical method validation and linearity evaluation. Journal of Chromatography B. 2009;877:2224-34.
13. Youden WJ, Steiner EH . Statistical Manual of the Association of Oficial Analytical Chemists. Washington DC: The Association of Oficial Analytical Chemists; 1975.
14. Dejaegher B, Heyden YV. Review: Ruggedness and robustness testing. Journal of Chromatography A. 2007;1158(1-2):138-57.
15. McWhinney B, Wallis S, Hillister T. Análisis de los 12 antibióticos beta-lactámicos en plasma humano por HPLC con detección ultravioleta. Journal of Chromatography B. 2010;878(22):2039-43.
16. Byrner D. Commission Decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results. Official Journal of the European Communities. L 221/8 [Cited 2014 Apr 23]. Available from: http://crl.fougeres.anses.fr/publicdoc/decision2002-657.2002
Recibido: 5 de mayo de 2015.
Aprobado: 27 de octubre de 2015.
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en Química de Medicamentos, Laboratorio de Análisis de Medicamento
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