Atividade antifúngica do óleo essencial de Melissa officinalis sobre isolados de Cladosporium sphaerospermum

Jessyca Marina Carneiro Gomes dos Santos; Camilla Pinheiro de Menezes; Abrahão Alves de Oliveira Filho; Edeltrudes de Oliveira Lima

PRODUCTOS NATURALES

Atividade antifúngica do óleo essencial de Melissa officinalis sobre isolados de Cladosporium sphaerospermum

Actividad antifúngica de aceite esencial de Melissa officinalis en aislados de Cladosporium sphaerospermum

Antifungal activity of the essential oil of Melissa officinalis on Cladosporium sphaerospermum isolates

Jessyca Marina Carneiro Gomes dos Santos,^I Camilla Pinheiro de Menezes,^I Abrahão Alves de Oliveira Filho,^II Edeltrudes de Oliveira Lima^I

I Universidade Federal da Paraíba. João Pessoa. Paraíba, Brasil.
II Universidade Federal de Campina Grande. Patos. Paraíba, Brasil.

RESUMO

Introdução: O gênero Cladosporium abrange muitas espécies de fungos contaminantes e oportunistas dematiáceos, sendo encontrados em diversos ambientes. As espécies C. cladosporioides, C. herbarum, C. oxysporum, C. carrionii e C. sphaerospermum têm sido observadas como responsáveis primárias por quadro de feohifomicoses superficiais, cromoblastomicoses e feohifomicoses profundas, que são micoses difíceis de tratar devido ao longo período de tratamento, às limitadas opções terapêuticas, às condições da imunidade do doente e à relativa resistência do fungo aos antifúngicos utilizados.
Objetivo: Avaliar a atividade antifúngica, in vitro, do óleo essencial de Melissa officinalis L. (Lamiaceae) sobre isolados clínicos de C. sphaerospermum.
Métodos: Foi realizada a determinação da concentração inibitória mínima e concentração fungicida mínima pela técnica de microdiluição e medida do crescimento micelial radial em diferentes intervalos de tempo.
Resultados: O óleo essencial de M. officinalis inibiu o crescimento de 100 % das isolados ensaiadas, tendo sua concentração inibitória mínima igual a 64 μg/mL. A concentração fungicida mínima foi estabelecida em 128 μg/mL e concentração fungicida mínima 256 μg/mL, sendo considerado um produto com forte atividade antifúngica. Este óleo também foi capaz de induzir inibição do crescimento micelial radial para as duas isoladas testadas, quando comparadas ao controle.
Conclusão: O óleo essencial de M. officinalis apresenta importante atividade antifúngica contra isolados de C. sphaerospermum, representando uma nova possibilidade no arsenal de produtos para terapêutica das micoses causadas por esses fungos.

Palavras-Chave: óleo essencial; Melissa officinalis; Cladosporium sphaerospermum.

RESUMEN

Introducción: El género Cladosporium incluye muchas especies de contaminantes y dematiáceos hongos oportunistas, que se encuentran en muchos entornos. Se ha observado que las especies C. cladosporioides, C. herbarum, C. oxysporum, C. carrionii y C. sphaerospermum se encargan de la superficie feohifomicosis marco primaria, cromoblastomicosis y feohifomicosis profundas, que son micosis difíciles de tratar debido al largo período de tratamiento y por las limitadas opciones de este para pacientes en determinadas condiciones de inmunidad y con resistencia a los agentes antifúngicos utilizados.
Objetivo: Avaluar la actividad antifúngica in vitro del aceite esencial de Melissa officinalis L. (Lamiaceae) en aislados clínicos de C. sphaerospermum.
Método: Se determinó la concentración mínima inhibitoria y la concentración mínima fungicida mediante la técnica de microdilución a través de la medición del crecimiento del micelio radial en diferentes intervalos de tiempo.
Resultados: El aceite esencial de M. officinalis inhibió el crecimiento de 100 % de los aislados ensayados, y su concentración mínima inhibitoria fue de 64 μg/mL. La concentración mínima fungicida se estableció en 128 μg/mL y 256 μg/mL, se considera un producto con fuerte actividad antifúngica. Este aceite también fue capaz de inducir la inhibición del crecimiento micelial radial para ambos aislados ensayados en comparación con el control.
Conclusiones: El aceite esencial de M. officinalis tiene importante actividad antifúngica frente a aislados de C. sphaerospermum, lo que representa una nueva posibilidad en el arsenal de productos para el tratamiento de las infecciones fúngicas causadas por estos hongos.

Palabras clave: aceite esencial; Melissa officinalis; Cladosporium sphaerospermum.

ABSTRACT

Introduction: Cladosporium genus includes many species of contaminants and opportunistic dematiaceous fungi that can be found in many environments. The speciesC. cladosporioides, C. herbarum C. oxysporum, C. carrionii and C. sphaerospermum have been observed to be responsible for primary frame feohifomycoses surface, and deep feohifomycoses and cromoblastomycoses, which are mycoses difficult to treat due to the long period of treatment, the limited treatment options for patients with specific immunity conditions and resistance to antifungal agents used.
Objective: To evaluate the antifungal in vitro activity of essential oil of Melissa officinalis L. (Lamiaceae) on clinical isolates of C. sphaerospermum.
Method : Minimum inhibitory concentration and minimum fungicidal concentration were determined by microdilution technique, measuring the radial mycelium growth in different time intervals.
Results: The results show that the essential oil from M. officinalis inhibited the growth of 100 % of tested isolates, and their minimum inhibitory concentration was of 64 μg/mL. Minimum fungicidal concentration was established at 128 μg/mL and 256 μg/mL. It is considered a product with strong antifungal activity. This oil was also able to induce inhibition of the radial mycelial growth for both tested isolates when compared to control.
Conclusions: The essential oil of M. officinalis has important antifungal activity against isolates of C. sphaerospermum which represents a new possibility in the arsenal of products for treatment of fungal infections caused by these fungi.

Keywords: essential oil; Melissa officinalis; Cladosporium sphaerospermum.

INTRODUÇÃO

Micoses oportunistas são cada vez mais comuns em pacientes imunocomprometidos. Sua incidência tem aumentado nas últimas décadas, pois a população em geral é mais exposta a fatores que favorecem a infecção micótica.^1,2

O gênero Cladosporium abrange muitas espécies de fungos contaminantes e oportunistas dematiáceos que são encontrados como saprófitas no solo, nas plantas e em materiais em decomposição. Algumas espécies têm uma relevância médica por estarem relacionadas a saúde humana, causando quadros de patologias oportunistas em pacientes imunossuprimidos.^3-5

As espécies C. cladosporioides, C. herbarum, C. oxysporum, C. carrionii e C. sphaerospermum têm sido observadas como responsáveis primárias por quadro de alergias, feo-hifomicoses superficiais (onicomicoses, ceratites, entre outros.), cromoblastomicoses e feo-hifomicoses profundas (meningites, quadro pulmonares, entre outras).^6-8

C. sphaerospermum é um importante fitopatógeno, sendo muito prejudicial para as culturas vegetais.⁷ Para os seres humanos e animais, nem todas as cepas são patogênicas, entretanto algumas cepas podem provocar ocasionalmente feo-hifomicose cutânea e cerebral independentemente do estado imunitário do hospedeiro.^9,10

Considerando a perspectiva de obtenção de novos fármacos para o tratamento dessas micoses, as plantas têm representado uma fonte valiosa de produtos para manutenção da saúde humana, havendo um aumento dessa tendência especialmente nos últimos anos, após numerosos estudos com produtos terapêuticos de plantas medicinais, em especial os óleos essenciais.^11,12

Com base na ampla atividade biológica apresentada pelos óleos essenciais, esse estudo tem como objetivo investigar a atividade antifúngica do óleo essencial das folhas de M. officinalis L. (Lamiaceae) contra duas cepas de C. sphaerospermum.

MÉTODOS

SUBSTÂNCIAS

O óleo essencial das folhas de M. officinalis L. sintético com alto teor de pureza foi obtido na empresa Quinari Ind. Com. Ltda., Ponta Grossa, Paraná, Brasil, sob o lote nº 0717/05209/F. O antifúngico padrão anfotericina B foi adquirido da Sigma-Aldrich, Brasil. As substâncias foram dissolvidas em DMSO (dimetilsulfóxido) e água destilada estéril. A concentração de DMSO não excedeu 0,5 % nos ensaios.

ESPÉCIES FÚNGICAS

Para realização dos ensaios de atividade antifúngica foram selecionados 2 isolados clínicos de C. sphaerospermum (URM 5 962 e URM 5 350), pertencentes à coleção de culturas da Micoteca do Departamento de Micologia, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco. Todos os isolados foram mantidos em Ágar Sabouraud Dextrose-ASD inclinado (DIFCO Laboratories Ltda, USA) a temperatura ambiente (28 ºC) e sob refrigeração (4 ºC).

INÓCULO

Para preparação do inóculo, os isolados fúngicas selecionadas foram mantidas no meio de cultura, por 10-14 dias, a temperatura de 28 ºC para atingirem um crescimento satisfatório. As recentes colônias fúngicas foram devidamente cobertas com 5 mL de solução salina estéril (NaCl 0,85 % p/v), e as suspensões feitas por suaves agitações e raspagens com auxílio de uma alça de platina em "L". A mistura resultante de conídios e fragmentos de hifas foi retirada e transferida para tubos de ensaio esterilizados. Em seguida, essas suspensões foram agitadas por 2 minutos com auxílio do aparelho Vortex (FANEM). Após agitação, cada suspensão teve sua turbidez comparada e ajustada àquela apresentada pela suspensão de sulfato de bário do tubo 0,5 da escala McFarland, a qual corresponde a um inóculo de aproximadamente 10⁶ unidades formadoras de colônias/mL (UFC/mL). Por fim, foi realizado contagem celular em câmara de Neubauer e as suspensões ajustadas no espectrofotômetro (SP220/200-1000nm, São Paulo, Brasil), para conter aproximadamente 1x10⁶ UFC/mL.^13,14

CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (MIC)

A determinação da concentração inibitória mínima foi realizada utilizando-se o óleo essencial de M. officinalis e anfotericina B. Os ensaios foram realizados por meio da técnica de microdiluição em caldo, utilizando placas de 96 orifícios estéreis e com tampa. Em cada orifício da placa, foi adicionado 100 μL do meio líquido caldo Sabouraud dextrose (CSD). Em seguida, 100 μL das soluções dos produtos teste na concentração inicial de 2 048 μg/mL, foram dispensados nas cavidades da primeira linha da placa. E por meio de uma diluição seriada em razão de dois, foram obtidas as concentrações de 4 a 1 024 μg/mL. Por fim, foi adicionado 10 μL do inóculo de aproximadamente 1-5 x 10⁶ UFC/mL das espécies fúngicas nas cavidades. As placas foram assepticamente fechadas e incubadas a 28 ^oC por 5 dias (e confirmada em 7 dias), sem anaerobiose, para realização da leitura. As CIMs para o óleo essencial e o antifúngico padrão foram definidas como a menor concentração capaz de inibir visualmente o crescimento fúngico verificado nos orifícios quando comparado com o crescimento controle. Os experimentos foram realizados em duplicata.¹⁵

DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO FUNGICIDA MÍNIMA (CFM)

A concentração fungicida mínima do óleo essencial foi determinada para todos os isolados clínicos de Cladosporium. Após a leitura da CIM em 7 dias, alíquotas de 10 μL foram retiradas de cada cavidade da placa de microdiluição onde não houve crescimento fúngico e foram subcultivadas em uma placa de Petri (90 x 15 mm) contendo ASD. O sistema foi incubado a 28 ^oC por 72 horas. A CFM foi definida como a menor concentração do óleo essencial, semeada em ASD, em que não houve crescimento, ou o crescimento foi menor que 3 UFC.^16,17 Os experimentos foram realizados em duplicata.

DETERMINAÇÃO DA CINÉTICA DE CRESCIMENTO MICELIAL

Para a determinação da cinética de crescimento micelial radial, foi selecionada a isolados clínicos de C. sphaerospermum URM 5 350, baseando-se nos resultados obtidos na determinação das CIMs e CFMs do produto avaliado. A inibição do crescimento micelial fúngico foi determinada utilizando-se a técnica de diluição em meio sólido. Este estudo baseou-se na medida do crescimento micelial radial em ASD adicionado do óleo essencial nas concentrações CIM, CIM X 2 e CIM X 4, em diferentes intervalos de tempo. Para a execução da técnica, inicialmente, uma porção de 2 mm de diâmetro foi tomado de uma cultura com crescimento de 7-14 dias em Ágar Sabouraud, a 28 ^oC, e colocada no centro de uma placa de Petri estéril com meio ASD adicionado do óleo essencial, nas diferentes concentrações. O sistema foi incubado a temperatura ambiente. Em diferentes intervalos de tempo (0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 e 14 dias) após incubação, o crescimento micelial radial da colônia fúngica foi medido e o resultado expresso em milímetros (mm).

Os controles foram realizados por meio da medida do crescimento micelial em ASD na ausência do óleo essencial, ou adicionado anfotericina B (CIM, CIM X 2 e CIM X 4). Foram realizados dois experimentos independentes em diferentes ocasiões e os resultados representam a média ± erro padrão dos dois experimentos.^18,19

RESULTADOS

Os resultados da CIM e CFM, do óleo essencial de M. officinalis sobre isolados clínicos de Cladosporium encontram-se representadas na tabela 1. Como pode ser observado, a CIM do óleo essencial testado foi de 64 μg/mL. A CFM do óleo essencial de M. officinalis variou entre 128 e 256 μg/mL. O antifúngico padrão (anfotericina B) exerceu efeitos inibitórios frente as cepas testadas, apresentando CIM de 16 μg/mL.

Todas as cepas fúngicas foram capazes de crescer em CSD sem a adição do óleo essencial ou antifúngico padrão, o que caracteriza sua viabilidade (controle da cepa).

Com base nos resultados encontrados dos valores de CIM e CFM, foi avaliada a interferência do óleo essencial de M. officinalis e da anfotericina B sobre a cinética de inibição do crescimento radial (mm) para a isolados clínicos C. sphaerospermum (URM 5 350) a fim de observar o efeito de diferentes concentrações desses produtos ao longo do tempo.

O ensaio de cinética de crescimento fúngico foi realizado utilizando a técnica de diluição em meio sólido e os resultados obtidos foram expressos na tabela 2 que mostram o crescimento micelial radial, em mm, de C. sphaerospermum (URM 5 350) na presença da CIM (256 μg/mL), CIMX2 (512 μg/mL) e CIMX4 (1024 μg/mL) do óleo essencial de M. officinalis e da anfotericina B (CIM 16 μg/mL), em função dos dias de exposição (0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14).

Este estudo revelou um efeito fungicida do óleo essencial de M. officinalis, quando testado nas diferentes concentrações, sobre os isolados clínicos de C. sphaerospermum. De acordo com a tabela 2, após os 14 dias do ensaio, observou-se uma redução do crescimento micelial dos fungos quando comparados com o grupo controle (não tratado), sendo o perfil de inibição do crescimento, semelhante para as duas cepas testadas. De modo que, o crescimento fúngico das duas cepas na presença do óleo essencial foi sempre menor que o observado para o ensaio controle. Como pode ser observado no 14º dia de exposição, a amostra controle de C. sphaerospermum apresentou crescimento micelial igual a 52 mm, enquanto que o crescimento máximo observado para a cepa na presença do óleo (CIM) foi de 6mm.

Em se tratando do antifúngico padrão (anfotericina B) também observou-se uma inibição no crescimento micelial induzido por esse antifúngico, para a cepa testada. Entretanto, a inibição foi menor que a apresentada pelo óleo essencial de M. officinalis, visto que na presença do óleo essencial, nas diferentes concentrações, o crescimento micelial radial máximo foi de 6 mm (CIM) no 14º. dia de exposição. Na presença da anfotericina B, houve um crescimento inibido quando comparado com o controle, porém que chegou a 17 mm (anfotericina B-CIM). Mesmo nas maiores concentrações (CIMx2 e CIMx4), o antifúngico padrão não foi capaz de inibir o crescimento de forma tão eficaz como observado com o óleo essencial, indicando o bom efeito antifúngico do óleo essencial testado.

DISCUSSÃO

Sartoratto e colaboradores elencaram critérios para categorizar o poder antimicrobiano de óleos essenciais com base no valor de CIM, onde óleos com CIM≤500 μg/mL são considerados com forte atividade antimicrobiana, com 500 μg/mL< CIM≤ 1 500 μg/mL possuem moderada atividade e CIM>1 500 μg/mL é considerado com fraca atividade.²⁰ Desta forma, pode-se considerar que o óleo essencial de M. officinalis possui forte atividade antimicrobiana frente às isolados clínicos de C. sphaerospermum testadas.

Desse modo, os valores de CIM para isolados clínicos de C . sphaerospermum obtidos neste trabalho apresentam coerência com os resultados observados por Ozcakmak e colaboradores que determinaram a CIM e CFM do óleo essencial de M. officinalis sobre cepas de Penicilium verrucosum. A CIM obtida foi de 125 μg/mL e a CFM igual a 250 μg/mL.²¹

Quando se compara a atividade de produtos naturais com a de antimicrobianos padrões, não existe ainda um consenso sobre o nível de inibição aceitável. A comparação dos resultados de atividade anti-Cladosporium do óleo essencial de M. officinalis com a da anfotericina B, mostra que o antifúngico padrão apresentou valor de CIM inferior as do óleo essencial. Entretanto, esta diferença entre as concentrações do óleo essencial e do antifúngico padrão pode ser explicada em termos pelo fato de que os componentes ativos no óleo compreendem apenas uma fração do óleo usado. Dessa forma, a concentração dos componentes ativos pode ser muito menor do que o antifúngico padrão utilizado. Portanto, é importante salientar que, se os componentes ativos forem isolados e purificados, eles provavelmente apresentarão atividade antimicrobiana superior às observadas no presente estudo.^22,23

Os fungos filamentosos de interesse médico possuem um aparelho de reprodução, cujos órgãos se diferenciam para servir à reprodução e um aparelho de vida vegetativa denominado micélio. Esse micélio é geralmente formado por um aglomerado de células, o qual pode ser filamentoso septado ou não-septado. A hifa, filamento fúngico ou um segmento do micélio filamentoso, constitui, em seu conjunto, o micélio dos fungos.²⁴

Assim como outros fungos filamentosos, fungos do gênero Cladosporium apresentam um simples ciclo celular não sexual, no qual forma-se uma colônia micelial via crescimento da hifa, que resulta do alongamento linear do seu ápice. Ainda, em um processo infeccioso, o crescimento longitudinal da hifa facilita a penetração nas camadas mais internas da pele, enquanto o crescimento lateral pode agravar os danos.^25,26

Por isso, alguns pesquisadores vêm investigando o potencial de óleos essenciais em inibir o crescimento micelial de fungos patogênicos por meio da medida do crescimento micelial radial, dada a sua importância no desenvolvimento das micoses.^14,27

A inibição do crescimento micelial, observada neste estudo, com o uso do óleo essencial de M. officinalis, foi semelhante ao encontrado por Menezes e colaboradores para este mesmo óleo contra cepas de Cladophialophora carrionii, sendo o óleo essencial capaz de inibir o crescimento micelial das duas cepas testadas nas concentrações de 256, 512 e 1024 μg/mL.²⁸

Estudos desenvolvidos por Moura e colaboradores avaliaram a ação do óleo essencial de de Punica granatum no controle do crescimento micelial de C. sphaerospermum, e observaram que na concentração de 25 μL/mL a taxa de inibição foi superior a 50 % do crescimento.²⁹

Moreira avaliando a cinética de crescimento micelial dos fungos dematiáceos C. cladosporidioides e F. compacta, frente ao óleo essencial de C. zeylanicum, observou total inibição do crescimento radial, na concentração de 125 μL/mL, ao longo de 14 dias de exposição.³⁰

A análise da composição do óleo essencial das folhas de M. officinalis foi realizada em estudos anteriores e resultou na identificação de 4 componentes principais. Entre os fitoconstituintes, o geranial foi o componente predominante do óleo essencial de M. officinalis com 52 % do total de constituintes presentes, este monoterpeno já demonstrou várias atividades antimicrobianas, em especial, antifúngica, reforçando e justificando o possível responsável pela atividade antifúngica observada contra as cepas tratadas nesta pesquisa. ^28,31

Portanto, pode-se concluir que o óleo essencial de M. officinalis apresenta um forte efeito antifúngico contra os isolados clínicos de C. sphaerospermum, tornando-se uma alternativa terapêutica para o combate desses fungos.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no presentan conflicto de intereses.

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Recibido: 22 de enero de 2018.
Aprobado: 22 de marzo de 2018.

Abrahão Alves de Oliveira Filho. Unidade Acadêmica de Ciências Biológicas (UACB). Centro de Saúde e Tecnologia Rural (CSTR). Universidade Federal de Campina Grande (UFCG). Bairro Jatobá-Campus de Patos-PB, Brasil.
Correo electrónico: abrahao.farm@gmail.com

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