PRODUCTOS NATURALES
Potencialidades de una mezcla de aceites esenciales frente a bacterias implicadas en el acné
Potentialities of a mixture of essential oils against bacteria involved in acne
Nerlis Paola
Pájaro1
Glicerio
León Méndez2
María
del Rosario Osorio Fortich3
Clemente
Granados Conde4
Miladys
Esther Torrenegra Alarcón5
1Universidad
de Sucre. Facultad de Ciencias de la Salud. Grupo de Ciencias Médicas y
Farmacéuticas. Sucre, Colombia.
2Centro de Investigación de Procesos del Tecnológico
Comfenalco (CIPTEC), Fundación Universitaria Tecnológico Comfenalco.
Affiliation ID60110627. Cartagena, Colombia.
3Universidad de Cartagena, Facultad de Ciencias Farmacéuticas,
Grupo de Investigación en Tecnología Farmacéutica, Cosmética
y de Alimentos (GITFCA). Cartagena, Colombia.
4Universidad de Cartagena, Facultad de Ingeniería, Grupo de
Investigación en Ingeniería, Innovación, Calidad Alimentaria
y Salud-INCAS. Cartagena, Colombia.
5Centro de Comercio y Servicio-GIBEI, Grupo de Investigación
de Nano, Biotecnología e Innovación, SENA, Regional Bolívar.
Cartagena, Colombia.
RESUMEN
Introducción:
El acné es una enfermedad dermatológica que afecta principalmente
adolescentes y adultos jóvenes.
Objetivo:
Evaluar la actividad antibacteriana de una mezcla de aceites esenciales sobre
tres cepas asociadas al desarrollo del acné (Propionibacterium acnes,
Staphylococcus epidermidis, y Staphylococcus aureus).
Métodos:
La composición química de la mezcla de aceites esenciales de cardamomo
(Elettaria cardamomum (L.) Maton), limonaria (Cymbopogon citratus
(DC.) Stapf) y clavo ( Eugenia caryophyllata T.) fue determinada
en proporciones 1:1:1 mediante cromatografía de gases acoplada a espectroscopia
de masas. Fue evaluada la actividad antimicrobiana, con el empleo de diferentes
tipos de agar y caldos específicos para la replicación bacteriana.
Se hicieron pruebas de evaluación de sensibilidad, al exponer las cepas
a concentraciones a 1 000 µg/mL de la mezcla de los aceites en caldo.
Resultados: Los componentes principales de la mezcla con abundancia relativa
mayor de 10 % fueron alcanfor, eucaliptol y eugenol, que pertenecen al grupo
de los monoterpenos, con reconocida actividad antinflamatoria. La mezcla de
aceites esenciales fue capaz de inhibir el crecimiento en más del 90 %
para las tres cepas a 1 000 µg/mL. La concentración mínima inhibitoria
determinada fue de 300 µg/mL para todas las cepas evaluadas (P. acnes,
S. epidermidis y S. aureus), pudiera ser factible el diseño
de formas farmacéuticas tópicas para el tratamiento del acné.
Conclusiones:
La mezcla de los aceites esenciales evaluada poseen actividad antibacteriana
sobre tres cepas asociadas al desarrollo del acné, por lo que es recomendable
el desarrollo de formas farmacéuticas tópicas con esta mezcla para
el tratamiento del acné.
Palabras clave: aceites esenciales; acné; Eugenia caryophyllata; Cymbopogon citratus; Elettaria cardamomum; Propionibacterium acnés; Staphylococcus epidermidis; Staphylococcus aureus.
ABSTRACT
Introduction:
Acne is a skin disease that affects mostly adolescents and young adults. Its
treatment is based on the use of anti-inflammatory and antibacterial drugs.
The essential oils (EO) being a possible alternative to this health problem.
Objective:
To evaluate the antibacterial activity of a mixture of EO on three strains
associated with the development of acne (Propionibacterium acnes, Staphylococcus
epidermidis and Staphylococcus aureus).
Methods:
The chemical composition of the mixture of EO of the cardamom (Elettaria
cardamomum (L.) Maton), lemongrass (Cymbopogon citratus (DC) Stapf)
and clove ( Eugenia caryophyllata T.) was determined in proportions 1:1:1
by gas chromatography coupled to mass spectroscopy. The antimicrobial activity
was evaluated using different types of agar and specific broths for bacterial
replication. The time of maximum optical density (OD620) was determined
for use as incubation time. Sensitivity evaluation tests were performed exposing
strains at concentrations at 1000 µg/mL of the mixture of oils in broth.
A mixture of broth ethanol:polysorbate-80 (95:4:1) was used to solubilize the
oils in the broth. The minimum inhibitory concentration (MIC) was determined
to the mixture of EO that inhibited growth by more than 90 %, by means of microdilution
methodologies in broth.
Results:
The main components of the mixture with higher relative abundance of 10
% were camphor, eucalyptol and eugenol, which belong to the group of monoterpenes
with recognized anti-inflammatory activity. The mixture of EO was able to inhibit
growth by more than 90 % for the three strains to 1000 µg/mL. The MIC subsequently
determined was 300 µg/mL for all strains tested (P. acnes, S.
epidermidis and S. aureus ).
Conclusions:
The mixture of evaluated essential oils possess antibacterial activity on three
strains associated with the development of acne, so it is advisable to develop
topical dosage forms with this mixture for the treatment of acne.
Keywords: essential oils; acne; antibacterial activity; Eugenia caryophyllata,Cymbopogon citratus; Elettaria cardamomum; Propionibacterium acnes; Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus.
INTRODUCCIÓN
Numerosas son las investigaciones que se realizan orientadas a la búsqueda de nuevos compuestos con actividades biológicas a partir de fuentes naturales. Dentro de ellos, un considerable número de estudios han sido encaminados hacia la evaluación de la actividad antimicrobiana de extractos y aceites esenciales (AE) de plantas medicinales y aromáticas. Para ello se han empleado las técnicas in vitro dada la sencillez y reproducibilidad de estas.1
En la actualidad, existen diversas patologías dermatológicas que afectan directamente la calidad de vida de los seres humanos y la más frecuente es el acné. Esta es una enfermedad inflamatoria crónica que afecta, principalmente, adolescentes y adultos jóvenes. Se calcula que antes de los 21 años entre el 80 y el 90 % de esta población ha estado expuesta a la enfermedad. Sin embargo, el acné puede persistir después de los 21 años y se sabe que 12 % de las mujeres mayores de 25 años aún sufren de acné facial.2-5 Constituye cada vez con más frecuencia un motivo de consulta médica, en el contexto de una conciencia social que, apuesta cada vez en mayor medida por la estética, y con posibilidades terapéuticas más novedosas y eficaces cada día.
Además de las lesiones físicas, el acné tiene implicaciones psicosociales para quien lo padece, pues en ocasiones el individuo llega a desarrollar baja autoestima, depresión, problemas en la dinámica familiar y laboral, aislamiento social, entre otras. Los pacientes pueden llegar a padecer un trastorno mental denominado dismorfofobia, la cual consiste en la percepción exagerada de los padecimientos cutáneos que se asocia con frecuencia al acné, en donde se preocupan por su "fealdad imaginaria" y pasan horas del día frente al espejo, obsesionados con la imagen percibida por ellos. Esto conlleva a una depresión clínica y a un trastorno obsesivo compulsivo o fobia social. Estos factores conducentes a la automedicación.6
El arsenal terapéutico para el acné consta de medicamentos tópicos y sistémicos que han demostrado su eficacia en la reducción de las lesiones. El mecanismo de acción de estos medicamentos está orientado, al menos, a uno de los cuatro factores fisiopatológicos reconocidos como responsables de la formación de las lesiones del acné, a saber, trastornos de la queratinización, hipersecreción sebácea, proliferación de Propionibacterium acnes y otras bacterias oportunistas (Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis) o actividad inflamatoria in situ.2
La elección del tratamiento apropiado depende de varios factores, como la forma clínica de la enfermedad (de retención o inflamatoria), la gravedad de esta y la respuesta del paciente a tratamientos previos.3-9
Resultados previos obtenidos por Matiz y otros,6 mostraron la actividad antibacteriana in vitro de AE obtenidos de las especies vegetales Elettaria cardamomun (L.) Maton,Cymbopogon citratus (DC) Stapf y Eugenia caryophyllata T. frente a bacterias asociadas al acné, los cuales presentaron resultados promisorios de manera individual. Dado que el acné inicia con una afección inflamatoria a la que le sobreviene un proceso infeccioso, se evaluó una mezcla de aceites esenciales de plantas de uso común en medicina popular frente a cepas bacterianas involucradas en dicha patología.
MÉTODOS
Se utilizaron como reactivos: Etanol y polisorbato-80 o Tween 80®, que fueron adquiridos de JT Baker (Phillipsburg, EUA); caldo Müeller Hinton (caldo MH), agar Müeller Hinton (agar MH), caldo Tripticasa Soya (caldo TSA), agar Tripticasa Soya (agar TSA), caldo Lutia Bertani (caldo LB) y agar Lutia Bertani (agar LB) fueron comprados de Merck KGaA (Darmstadt, Alemania), además de Gentamicina sulfato de Biopex SAC (Perú, Estándar Secundario, Lote: 10C256). Las cepas bacterianas provinieron de laAmerican Type Culture Collection (ATCC): Propionibacterium acnes (ATCC 11827), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) y Staphylococcus epidermidis (ATCC 12 228). Los AE (tabla 1) se adquirieron ya purificados en Green Andina Colombia Ltda. (Bogotá, Colombia).
Para la preparación de la mezcla de aceites esenciales, se trabajó a partir de los AE adquiridos de E. caryophyllata,C. citratus y E. cardamomum en proporciones 1:1:1. 10
ANÁLISIS DE ACEITES ESENCIALES POR CROMATOGRAFÍA DE GASES/ESPECTROMETRÍA DE MASA (GC/MS)
Un cromatógrafo de gases Agilent 7890A acoplado a un espectrómetro de masas Agilent 5975C fue utilizado, con una columna capilar HP-5 (5 % fenil metil siloxano, 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm). Puerto de inyección split/splitless, con inyección automática Agilent 4513A. El helio grado 5 fue empleado como gas de arrastre, a una velocidad de 1 mL/min. La temperatura del inyector, línea de transferencia y fuente de iones fue de 250 °C, 280 °C y 230 °C, respectivamente.11-14 Programación del horno 45 °C (1 min) hasta 300 °C, aumentado a una velocidad de 5 °C por min. El espectrómetro de masas fue operado en modo ionización electrónica a 70 eV. El espectro de masas y el cromatograma iónico total fue obtenido por escaneo automático, en un rango de masas de m/z 30-700. La detección de los compuestos se realizó por comparación del espectro de masas, en cada tiempo de retención, con los reportados en la base de datos Nist-2008.
ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA IN VITRO
La actividad antimicrobiana de la mezcla de aceites esenciales fue evaluada mediante el empleo de las cepas bacterianas S. aureus, S epidermidis y P. acnés, las cuales fueron cultivadas en los medios MH, LB y TSA, respectivamente. El protocolo para el cultivo fue realizado de acuerdo con las indicaciones establecidas por el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI).15
De cada inóculo se tomó entre 3 y 4 colonias bien diferenciadas y morfológicamente similares de las bacterias previamente sembradas, posteriormente estas fueron suspendidas en tubos de ensayo en caldo homólogo estéril. Luego, los cultivos bacterianos fueron incubados a 35± 2 ºC y se verificó su crecimiento por medición de la densidad óptica (DO) a 620 nm en lector de microplacas (Multiscan EX Thermo®, EE.UU.). Cuando la suspensión bacteriana alcanzó una DO620 entre 0,08-0,1 unidades, equivalente a 0,5 en la escala de McFarland (1 x 108 UFC/mL); la suspensión fue diluida a fin de obtener una suspensión de trabajo de 5 x 105 UFC/mL en los ensayos biológicos.
Para la evaluación fue necesario que las cepas bacterianas estuvieran en el momento de mayor densidad óptica. Para ello, 0,1 mL de inóculo diluido fue adicionado a 9,9 mL del caldo específico, incubado a 35± 2 ºC y verificada a intervalos regulares la DO 620 de la suspensión bacteriana en el lector de microplacas.16 El tiempo en el que se logró el mayor valor, se empleó como tiempo de incubación en todos los ensayos. La mezcla de AE fue diluida en caldo:etanol:polisorbato-8017,18 en diferentes cantidades, y posteriormente incubada con las bacterias seleccionadas en placas de 96 pocillos a 35± 2 °C por el tiempo definido para cada bacteria según las curvas de crecimiento. Trascurrido este tiempo, los porcentajes de viabilidad celular frente al blanco de máximo crecimiento (caldo con inóculo) fue determinado, con el objetivo de seleccionar la mezcla más adecuada. Las soluciones de los AE fueron preparados a concentración de 1 000 μg/mL, acorde con el criterio de Gibbons,19 quien considera como promisorios los productos que presenten valores de concentración mínima inhibitoria (CMI) inferior a 1 000 μg/mL. Estas soluciones se incubaron con las suspensiones bacterianas a 35± 2 ºC, con la utilización de gentamicina sulfato (0,016 mg/mL) como control positivo de actividad antibacteriana. Al final del periodo de incubación, las placas se agitaron durante 5 min a 100 rpm, se determinó la DO620 en lector de microplacas y se estimó la viabilidad por comparación frente al blanco de máximo crecimiento.
Para determinar la concentración mínima inhibitoria a diferentes concentraciones, fueron utilizadas entre 50 y 1 000 µg/mL de la mezcla de AE, por lo cual 50 μL de las suspensiones de las cepas fueron tratadas con 50 μL de tratamiento e incubadas en placas de 96 pozos, y selladas durante la incubación para reducir la evaporación de los AE. Al finalizar, las cepas fueron sometidas a agitación (100 rpm, 5 min) y fue determinada la DO620 en lector de microplacas. La CMI (µg/mL) se calculó como la mínima concentración de la mezcla de los AE que inhibió completamente el crecimiento, comparado contra pozos de caldo puro. Se emplearon como control pozos con caldo inoculado (máximo crecimiento) y con gentamicina (30 µg/mL).5,6,20
Los resultados fueron presentados como la media ± error estándar de la media (ESM), correspondientes a tres ensayos independientes. La organización de los datos fue realizada a través de la aplicación Excel 2010. Para el análisis estadístico empleando el paquete estadístico GraphPad Prism V5,00 paraWindows. Los datos fueron analizaron mediante la prueba t de student.
RESULTADOS
El análisis de la composición química de la mezcla de aceites esenciales por gases/espectrometría de masa se presenta en la tabla 2.
Cabe mencionar también que para la cuantificación de los componentes principales de la mezcla de AE investigados no fue necesaria la elaboración de curvas de calibración con estándares de alta pureza, ya que la cromatografía de gases acoplada a la espectrometría de masas permitió establecer los tiempos de retención, así como la concentración relativa para cada uno de los componentes. En paralelo, esta técnica instrumental permitió establecer la identidad de cada uno de los componentes principales, incluso los que se encontraban a niveles de traza, mediante la comparación del espectro de masas obtenido experimentalmente para cada componente versus el espectro de masas de referencia de la base de datos NIST-2008. De esa manera, se pudo establecer la identidad y concentración relativa de cada uno de los componentes presentes en la mezcla de los aceites esenciales investigados.
Las curvas de crecimiento mostraron que las cepas bacterianas del género Staphylococcus se encuentran en la etapa final de la fase exponencial a las 20 horas, mientras que para P. acnes ocurre a las 48 horas. Por lo tanto, en este trabajo, se consideró el punto final de incubación en los bioensayos de actividad antibacteriana a las 48 horas. Para incorporar los AE al medio de cultivo se estableció que la mezcla de solventes que contenía etanol al 4 % y polisorbato-80 al 1 % no inhibieron el crecimiento de ninguna de las cepas: por esta razón se seleccionó el sistema solvente caldo: etanol: polisorbato-80 en proporción 95:4:1.
Los resultados de la evaluación de la sensibilidad antibacteriana en la mezcla de AE (tabla 3), permitió identificar a esta mezcla como promisoria, tomando como criterio de selección aquellos que fueron capaces de inhibir en más de un 90 % a las tres cepas a una concentración de 1 000 μg/mL.
La concentración mínima inhibitoria fue determinada al utilizar caldo inoculado y estandarizado, al que se adicionaron soluciones de aceites a diferentes concentraciones, provocando una dilución. Esto explica el por qué la absorbancia (DO620) del caldo puro es mayor que la de los demás pozos, al tiempo inicial de incubación. Al final de esta, se leen las absorbancias de todos los pozos. Se considera inhibición total, en aquellos con valores inferiores al del caldo puro. La mayor concentración de aceite capaz de lograr esto se denomina concentración mínima inhibitoria. Los valores se presentan en la tabla 4.
DISCUSIÓN
La eficacia de la mezcla de aceites esenciales se corresponde necesariamente con su composición. El análisis CG/MS permitió confirmar la composición porcentual de la mezcla de AE, tal composición (cualitativa) es consistente con la reportada en la literatura (tabla 2). De hecho, los componentes mayoritarios de E. caryophyllata reportados son eugenol, eugenol acetato y cariofileno. Para E. cardamomum son eucaliptol, 2-careno, linalool y para C. citratus son limoneno, α-citral, β-citral y β-tujeno.6 Igualmente, varios AE tales como Ocimum sanctum L. y Ocimum americanum L. han sido reportados como efectivos frente a P. acnés, siendo sus componentes mayoritarios eugenol (41,5 %), g-cariofileno (23,7 %) y metil eugenol (11,8 %), de geraniol (32,0 %) y neral (27,2 %).21 Varios de los cuales están presentes en la mezcla de AE evaluada. Adicionalmente, de acuerdo con la literatura, los componentes más abundantes de la mezcla de los aceites fueron, eucaliptol, eugenol y alcanfor, los cuales tienen reconocida actividad anti-inflamatoria.
La información sobre la actividad de antibacteriana de aceites esenciales frente a cepas asociadas con el desarrollo del acné es todavía escasa. Varios estudios, entre los realizados por Matiz y otros,6 determinaron la actividad antibacteriana in vitro de 19 AE frente a bacterias asociadas al acné y encontraron que los AE de Thymus vulgaris L., Cinnamomum verum J. Presl, E. caryophyllata T., E. cardamomum y C. citratus, alcanzaron las más bajas CMI frente a P. acne, S. aureus y S. epidermidis. Otro estudio realizado por Torrenegra y otros,5 determinaron la actividad antibacteriana in vitro de AE frente a microorganismos implicados en el acné, cuyos resultados mostraron que las bacterias fueron más sensibles al AE de orégano "borde blanco" (Plectranthus amboinicus L.) obtenido mediante ambos métodos de extracción. Además, este aceite presentó el mayor contenido de monoterpenos oxigenados con reconocida actividad antibacteriana, como son el carvacrol y el timol.
Los resultados obtenidos de la evaluación de la sensibilidad bacteriana (tabla 3), demostraron que la mezcla de AE presentó resultados promisorios. De hecho, la mezcla evaluada fue tan efectiva como el control positivo (Gentamicina sulfato de Biopex SAC).22 Posiblemente, la mayor sensibilidad de los microorganismos a la mezcla de AE se deba a que presentó una alta concentración de monoterpenos oxigenados como el eugenol. Además, el efecto sinérgico obtenido al utilizar la mezcla representa una importante ventaja frente al uso de AE individuales, dado que se utiliza una menor cantidad y se potencia su efecto.10 Por lo tanto, queda demostrada la actividad antibacteriana de la mezcla de AE de E. cardamomum, E. caryophyllata y C. citratus. Esto se fundamenta con investigaciones científicas anteriores en donde se describe que las bacterias Gram positivas son más sensibles a los AE, que las bacterias Gram negativas, debido a un aumento de la permeabilidad de la membrana a iones pequeños, lo cual afecta la estabilidad estructural de la membrana y desestabiliza el empaquetamiento de la bicapa lipídica, llevando a la lisis bacteriana,23 lo que justifica el uso tradicional de estas especies frente a patologías dermatológicas causadas por microorganismos.24,25
Otras investigaciones han aportado evidencia del uso de distintos aceites esenciales y sus componentes para el tratamiento del acné 26,27 entre ellos el aceite de árbol de té de la planta Melaleuca alternifolia,28 aceite de cedro29 y mezclas de los AE palo de rosa, clavo de olor y litsea.30
Los resultados obtenidos aportan evidencia de la capacidad antibacteriana de los aceites esenciales. Cabe destacar que las pruebas in vitro constituyen un buen aporte para el conocimiento de las propiedades de los aceites esenciales.
La mezcla de aceites esenciales de E. cardamomum, C. citratus y E. caryophyllata en proporciones (1:1:1), alcanzó bajas CMI frente a las tres cepas bacterianas involucradas en el desarrollo del acné, por tanto, es recomendable el desarrollo de formas farmacéuticas tópicas con esta mezcla para el tratamiento del acné.
Agradecimientos
Los autores agradecemos a las Universidades de Cartagena y de Sucre, a la Fundación Universitaria Tecnológico Comfenalco y al SENA por facilitar espacio, recursos y tiempo de los investigadores.
Conflicto de interés
Los autores declaran que no presentan conflicto de interés.
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Recibido: 22 de
noviembre de 2018.
Aprobado: 20 de enero de 2019.
Nerlis Paola
Pájaro
Universidad de Sucre. Facultad de Ciencias de la Salud. Grupo de Ciencias Médicas
y Farmacéuticas. Sucre, Colombia.
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