Método cromatográfico para el control de calidad del producto inyectable lisinato de ibuprofeno

ARTÍCULO ORIGINAL

 

Método cromatográfico para el control de calidad del producto inyectable lisinato de ibuprofeno

 

Chromatographic method for the quality control of ibuprofen lysinate injection

 

 

Yónica Prens Suárez1
Nailia González Martínez1
Odalys Madrazo Alonso1

1Empresa Laboratorios AICA, Laboratorio de Investigación y Desarrollo. La Habana, Cuba.

 

 

RESUMEN

Introducción: El lisinato de ibuprofeno es un antiinflamatorio no esteroideo, que se utiliza fundamentalmente como tratamiento de primer paso del dolor. Este producto en su forma farmacéutica inyectable, no se encuentra reportado en las monografías oficiales y es necesario el diseño de un método de control que garantice el cumplimiento de los atributos de calidad en el producto terminado.
Objetivo: Validar un método analítico para cuantificar el lisinato de ibuprofeno durante el control de calidad del producto.
Métodos: Se utilizó un método por cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa y se trabajó a una longitud de onda de 220 nm, con un flujo de 1,5 mL/min y una mezcla de ácido ortofosfórico y acetonitrilo como fase móvil. Para demostrar la confiabilidad del método se realizó una validación prospectiva, donde se comprobaron los parámetros de linealidad, precisión, exactitud y especificidad. Se evaluó la aptitud del sistema cromatográfico y se midieron resolución, asimetría del pico principal y número de platos teórico en la columna.
Resultados: El sistema fue capaz de separar adecuadamente el principio activo en la muestra con una resolución entre picos de 35,11. No se observó interferencia de la matriz a la longitud de onda que se trabajó. Se obtuvieron coeficientes de correlación y determinación mayores de 0,98 en la linealidad y se recobró alrededor del 100 % de las concentraciones preparadas para la exactitud. En cada parámetro de la validación se determinó el coeficiente de variación, el cual se mantuvo por debajo del límite establecido para cada caso.
Conclusiones: Se obtuvo un método específico para la separación del ibuprofeno y su cuantificación dentro del inyectable. Los resultados obtenidos con la validación, respaldan la confiabilidad y seguridad de este para el control rutinario del producto terminado.

Palabras clave: ibuprofeno; antinflamatorio no esteroideo; inyectable; cromatografía; validación.

ABSTRACT

Introduction: Ibuprofen lysine is a non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID), which is used primarily as a first-pass treatment for pain. This product in the dosage forms of injection isn´t reported in the official monographs, and it is necessary to design a control method for checking compliance with the quality attributes of the drug.
Objective: Validate an analytical method to quantify the lysinate of ibuprofen during the quality control of the product.
Methods: A reverse phase high resolution liquid chromatography was used, with wavelength of 220 nm and flow of 1.5 mL/min with a mixture of orthophosphoric acid and acetonitrile as the mobile phase. A prospective validation was performed to demonstrate the reliability of the method, checking linearity, precision, accuracy and specificity. The aptitude of the chromatographic system was also assessed by measuring resolution, asymmetry of the main peak, and number of theoretical plates in the column.
Results: The system was able to separate adequately the active principle in the sample, with a resolution between peaks of 35.11. No interference from the matrix was observed at the working wavelength. For linearity were obtained coefficients of correlation and determination greater than 0.98 and around 100 % of the concentrations prepared for accuracy were recovered. In each parameter of the validation the coefficient of variation was determined, which was kept below the limit established.
Conclusions: It was obtained a specific method for the separation of ibuprofen and its quantification within the injection. The results of validation support its reliability and safety for the routine control of the finished product.

Keywords: ibuprofen; an anti-inflammatory non-steroidal; injectable; chromatography; validation.

 

INTRODUCCIÓN

El lisinato de ibuprofeno, es un analgésico antinflamatorio no esteroideo (AINE), indicado en procesos inflamatorios, cefaleas, lumbociática u otros síntomas radiculares y es ampliamente utilizado en el tratamiento de dolores traumáticos y reumáticos.1-7 Es un derivado quiral del ácido propiónico, formado por una mezcla racémica de ibuprofeno sustancia pura y el anión lisina.8,9 Esta combinación aumenta la solubilidad en agua a un 17 %, comparado con la de la sustancia pura (menos del 0,1 %),8 y ha sido seleccionada la sal para la elaboración de la forma inyectable.

Los antiinflamatorios no esteroideos son de naturaleza analgésica, antitérmica y antiinflamatoria y poseen distintos grados de acción contra el dolor, la fiebre y la inflamación.1-7

Este medicamento en su forma inyectable fue desarrollado por la Empresa Laboratorios AICA, como parte de la estrategia de incorporación de nuevos productos al Cuadro Básico de Medicamentos en Cuba. Se presenta en ampolletas de 3 mL, con una concentración de 133,3 mg/mL para administración intramuscular.

La farmacopea no reporta un método de control para el lisinato de ibuprofeno, ya sea como principio activo o como producto terminado de forma inyectable.10,11 Con este antecedente, fue necesario desarrollar una metodología que admitiera controlar los atributos de calidad del medicamento durante su fabricación y el control de calidad, para su posterior comercialización.

Las regulaciones de buenas prácticas de producción y laboratorio, establecen la validación como una garantía de que los métodos, procesos y sistemas, cumplen con el objetivo para el cual fueron diseñados.12

Este trabajo tiene como objetivo validar un método cromatográfico para cuantificar el lisinato de ibuprofeno durante el control de calidad del producto.

 

MÉTODOS

Para desarrollar la técnica analítica, se utilizó la cromatografía líquida de alta resolución y se tomó como punto de partida la información recopilada durante el desarrollo del producto.13 Se trabajó con una fase móvil compuesta por una mezcla de una solución de ácido orto fosfórico (1 en 1 000) con acetonitrilo, en una relación de 45-55, debidamente filtrada y desgasificada. Se estableció un volumen de muestra de 20 mL, con el manejo de un detector a una longitud de onda fija de 220 nm y un flujo de fase móvil de 2 mL/min durante 15 min. Se evaluaron los parámetros resolución, asimetría y eficiencia para comprobar la aptitud del sistema. La evaluación estadística de los resultados se realizó mediante la utilización del programa Statgraphics Plus, versión 5.

Solución de referencia 0,1 mg/mL: 17,1 mg de lisinato de ibuprofeno, equivalentes a 10 mg de ibuprofeno base, exactamente pesados y disueltos en 100 mL con fase móvil.

Solución de ensayo 0,1066 mg/mL: 2 mL del inyectable, equivalentes a 266,66 mg de ibuprofeno base, exactamente medidos, diluidos con 100 mL de fase móvil. De esta solución se tomaron 4 mL y se diluyeron a 100 mL con fase móvil.

Las muestras se analizaron por triplicado, en una columna Nucleosil 100 C18 de 5 mm, dimensiones de 250 x 4,6 mm. El contenido de lisinato de ibuprofeno dentro del producto debe estar entre 90 y 110 %.

La validación se realizó al evaluar parámetros de linealidad, precisión, exactitud y especificidad.12

 

ESPECIFICIDAD

La solución de ensayo de 0,1066 mg/ml y un placebo preparado a la misma concentración, fueron inyectados en el cromatográfo para comprobar que entre ellos no existan interferencias a la longitud de onda de trabajo.

Se realizó una especificidad por degradación, para la cual se trasvasaron 2 mL de la muestra de 99,85 % de concentración, a cuatro erlenmeyers de 25 mL y se sometieron a condiciones de estrés. Se utilizó un medio básico al adicionar 1 mL de hidróxido de sodio 1 mol/L, además de uno ácido, con la adición de 1 mL de ácido clorhídrico 1 mol/L. Para la oxidación se adicionaron 3 gotas de peróxido de hidrógeno al 30 %. Las cuatro muestras se colocaron en un baño de agua a 105 ºC durante 1 h. Posteriormente se neutralizaron y se inyectaron en el cromatográfo, además de comparar los cromatogramas con un patrón. Se calculó el porcentaje de ibuprofeno en las muestras degradadas, para analizar la influencia de cada medio estudiado sobre el producto.

 

LINEALIDAD DEL SISTEMA

La curva de calibración se preparó de la siguiente forma:

  • Se pesaron 455,5 mg de lisinato de ibuprofeno, sustancia de referencia primaria, Lote A-1355-128, equivalentes a 266,6 mg de ibuprofeno, los cuales se trasvasaron a un matraz aforado de 100 mL. Este se disolvió y enrasó con fase móvil.
  • Se tomaron alícuotas de 2, 3, 4, 5 y 6 mL, correspondientes al 50, 75, 100,125 y 150 % de ibuprofeno -respectivamente- y se trasvasaron a matraces aforados de 25 mL, los cuales se completaron hasta volumen en cada uno de ellos, con fase móvil y de mezclado. Estos porcentajes representan soluciones patrones de concentraciones al 0,000258; 0,000387; 0,000516; 0,000646 y 0,000775 mol/L.
  • Se inyectaron las cinco soluciones en el cromatógrafo, cada una por triplicado.
  • Se repitió la operación en dos días diferentes.
  • Se verificó la linealidad y proporcionalidad mediante la utilización del programa Statgraphics plus (versión 5), para construir un gráfico de concentración entre el área, y se evaluaron los datos obtenidos mediante las siguientes opciones:
  • Significación de la regresión: se determinó el coeficiente de correlación (r) y el de determinación (r2).
  • Verificación de la linealidad: se determinó el coeficiente de variación (CV) de los factores de respuesta.
  • Verificación de la proporcionalidad: se verificó que los resultados del ensayo incluyeran el cero para el grado de probabilidad definido (95 %).

 

Criterios de aceptación: r ≥ 0,99; r2 ≥ 0,98; CVtotal < 5 %; texp < ttab.

PRECISIÓN

I. Repetibilidad: a partir del inyectable se preparó un pool del cual se tomaron alícuotas de 1; 2 y 3 mL y se trasvasaron a matraces aforados de 100 mL, añadiendo fase móvil hasta completar volumen. Se tomaron 4 mL de cada una de estas soluciones, llevándose a volumen con fase móvil en matraces aforados de 100 mL. Estas soluciones corresponden al 50, 100 y 150 % de Ibuprofeno. Cada nivel de concentración se preparó cinco veces. Se preparó un patrón de lisinato de ibuprofeno a una concentración de 0,1 mg/mL y se inyectaron todas las soluciones en el cromatógrafo.

Se calculó el contenido de ibuprofeno para cada concentración y se evaluó la variabilidad de los resultados mediante el coeficiente de variación y del estadígrafo G de Cochran para un 95 % de confianza, n-1 grados de libertad y tres niveles de concentración.

Criterios de aceptación: CV £ 1,5 % en cada nivel ensayado. Gexp < Gtab.

II. Precisión Intermedia: se seleccionaron del laboratorio dos analistas para repetir el procedimiento analítico en dos días diferentes por sextuplicado. Se calculó el contenido de ibuprofeno para cada día y para cada analista. Se compararon los resultados mediante un análisis de varianza (ANOVA) con el estadígrafo F de Fischer y se determinó el coeficiente de variación total.

Criterios de aceptación: CV £ 2,0 % para el total de las determinaciones realizadas en el laboratorio. No existen diferencias significativas en las concentraciones calculadas entre días ni entre analistas (valor de p ≥ 0,05 en la prueba de Fisher).

EXACTITUD

Se realizó mediante el uso del método de los placebos cargados.

Preparación del placebo: se prepara según el procedimiento de fabricación del inyectable sin adición del ingrediente farmacéutico activo (IFA).

  • Se pesaron cantidades de lisinato de ibuprofeno correspondientes a 60, 80, 100, 110 y 120 % de dicho IFA. Posteriormente se añadió la cantidad de placebo equivalente a la alícuota tomada de la muestra del inyectable (2 mL), se disolvió y se llevó a 100 mL con fase móvil. De cada una de estas soluciones, se tomaron por quintuplicado alícuotas de 4 mL y se diluyeron con fase móvil en matraces aforados de 100 mL.
  • Se preparó una solución estándar de 0,1 mg/mL.
  • Todas las soluciones se inyectaron en el cromatógrafo y se calculó el contenido de ibuprofeno para cada nivel en mg/mL y en porcentaje (%).

La exactitud se evaluó de la siguiente forma:

  • Se calculó el recobrado para cada concentración y su media se comparó con el 100 % mediante la t de Student.
  • Se verificó la variabilidad en el recobrado a través del coeficiente de variación.
  • Se graficó la concentración añadida recuperada, para evaluar la linealidad de la relación entre estas y se calculó la pendiente y el intercepto.

Criterios de aceptación: no existen diferencias significativas entre la media de los porcientos de recobro y el 100 %, para un 95 % de probabilidad y n-1 grados de libertad (texp< ttab).

Los recobrados deben estar entre 98,0 y 102,0 %; CVtotal £ 2,0 %.

El valor de la pendiente debe ser aproximadamente 1 y su intervalo de confianza debe comprender un intervalo alrededor de 1.

 

RESULTADOS

En la evaluación de la aptitud del método se obtuvo que la resolución entre picos fue 35,11 y el pico principal mostró una asimetría de 0,54. La eficiencia se evaluó a través del número de platos teóricos, el cual fue 13 776.

Los cromatogramas obtenidos en el ensayo de especificidad a partir de la muestra y el placebo se muestran en la figura 1. En ellos se puede observar que la matriz no aportó señal a la longitud de onda de trabajo. En la especificidad por degradación la concentración de la muestra varió de 99,85 % a 88,21 % (medio ácido), 100,05 % (medio básico), 94,93 % (termólisis) y 80,03 % (oxidación). Se muestra además la presencia de picos secundarios.

 

La tabla resume los resultados obtenidos en cada punto de la validación. La figura 2 exhibe una curva de calibración donde se manifestó un aumento lineal y proporcional de las áreas con la concentración de la muestra analítica, con un coeficiente de correlación de 0,9996 y de determinación de 0,9993. El intercepto de la curva no es significativo con un valor de t de Student obtenido en el Test de proporcionalidad de 2,72. Para cada punto de la curva se evaluaron los factores de respuesta, los cuales fueron semejantes entre si y cercanos al valor de la pendiente, con un coeficiente de variación total de 4,13 %.

 

 

Se recobró alrededor del 100,0 % de la concentración añadida en cada nivel de la exactitud ensayado, con un coeficiente de variación total de 0,072 %. Se obtuvo una t experimental de 0,14 por debajo de la tabulada (2,09), lo que indica que la media de la cantidad recuperada no difiere del 100 %. Otra variante para demostrar exactitud fue a través de la linealidad del método donde se obtuvo una curva con pendiente igual a 1 y un intercepto no significativo.

La precisión del sistema se evaluó a través de la repetibilidad y la precisión intermedia. En la repetibilidad el coeficiente de variación total fue de 0,59 % y el valor de G obtenido fue 0,5932; por debajo del tabulado (0,7977). En el caso de la precisión intermedia, se obtuvieron coeficientes de variación por debajo de la unidad, tanto entre analistas como entre días. A su vez los resultados se analizaron mediante ANOVA, con un valor p de 0,9919 y 0,2991 entre días y entre analistas, respectivamente, para un 95,0 % de confianza.

 

DISCUSIÓN

Se obtuvieron tiempos de retención relativos de 0,16 en el pico de la lisina y 1 para el ibuprofeno y una desviación mínima de la forma gaussiana para éste último, por lo cual el método fue capaz de separar y resolver adecuadamente el pico de interés en la mezcla.

Se demostró la especificidad del método para evaluar el producto en las condiciones de trabajo establecidas. En el cromatograma de la muestra solamente se obtuvo la señal del analito sin interferencia de la matriz. Además, en el ensayo de degradación, el método detectó los cambios que sufrió el medicamento sometido a condiciones de estrés, lo cual demuestra que es sensible a éstos.

Se obtuvieron coeficientes estadísticos en la curva de calibración que explican un alto grado de correlación entre la concentración y la señal medida, por lo cual el método fue capaz de generar -ante cualquier cambio en la concentración- un resultado directamente proporcional a esta característica. Con un coeficiente de variación en los factores respuesta menor del 5 % y un valor de texp por debajo del tabulado para el intercepto, se puede afirmar que existió linealidad y proporcionalidad en el rango de concentraciones escogidas.

El método fue exacto, al recuperarse siempre la concentración añadida, con una variabilidad mínima entre las dispersiones. No existieron diferencias significativas entre la media del recobrado y el 100 %. Se demostró estadísticamente la relación lineal entre ambas concentraciones.

El valor del coeficiente de variación calculado en la repetibilidad y la G experimental obtenida demostraron que la variabilidad en el proceso analítico es mínima y que no existieron diferencias significativas entre las dispersiones independientemente de las concentraciones trabajadas. Para la precisión intermedia, en el análisis mediante ANOVA, el valor de p obtenido fue superior a 0,05, tanto entre analistas como entre días, por lo que no hubo diferencias estadísticamente significativas entre las medias de las dos variables, para un 95 % de confianza.

Se obtuvo un método analítico adecuado para cuantificar el lisinato de ibuprofeno en el inyectable para aplicar al control de calidad. La validación demostró que dicho método es exacto, preciso, lineal y específico y fue capaz de generar los valores de concentración reales del medicamento -en el momento del análisis- y de detectar los cambios que en él se produzcan.

 

Conflicto de interés

Los autores declaran que no presentan conflicto de interés.

 

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Recibido: 27 de noviembre de 2018.
Aprobado: 7 de enero de 2019.

 

 

Yónica Prens Suárez
Empresa Laboratorios AICA, Laboratorio de Investigación y Desarrollo, Ave 23, S/N, e/268 y 270, San Agustín, La Lisa. La Habana, Cuba.

Correo electrónico: yonicap@aica.cu

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