Evaluación del desempeño del método analítico para la cuantificación de la materia prima de cefalexina, cefaclor, cefoxitina sódica y cefixima

Lisandra García Borges; Caridad Margarita García Peña; Marilyn López Armas; Vivian Martínez Espinosa; Alfredo Fernández Martínez; Marlén Cárdenas Peña

Evaluación del desempeño del método analítico para la cuantificación de la materia prima de cefalexina, cefaclor, cefoxitina sódica y cefixima

ARTÍCULO ORIGINAL

Evaluación del desempeño del método analítico para la cuantificación de la materia prima de cefalexina, cefaclor, cefoxitina sódica y cefixima

Evaluation of the analytical method performance for quantification of raw materials for cefalexin, cefaclor, sodium cefoxitin and cefixime

Lisandra García Borges,^I Caridad Margarita García Peña,^IMarilyn López Armas,^IVivian Martínez Espinosa,^I Alfredo Fernández Martínez,^II Marlén Cárdenas Peña^II

^I Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). La Habana, Cuba.
^II Empresa Farmacéutica 8 de Marzo. La Habana, Cuba.

RESUMEN

Introducción: garantizar las buenas prácticas de producción, liderado por la necesidad de validar los métodos analíticos que permiten cuantificar estándares de calidad en la materia prima de los productos farmacéuticos, constituye una estrategia importante para certificar la calidad de los medicamentos según las normas regulatorias de cada país. Para este trabajo se seleccionó las cefalosporinas, grupo compuesto por antibióticos ampliamente utilizado en la práctica clínica, de escasa toxicidad y amplio margen terapéutico.
Objetivo: evaluar el desempeño de los métodos analíticos empleados en la cuantificación del Ingrediente Activo Farmacéutico para ser utilizados durante el control de calidad en la producción nacional de cefalexina, cefaclor, cefoxitina sódica y cefixima.
Métodos: en la cuantificación de los Ingredientes Activos Farmacéuticos se aplica la Cromatografía líquida de alta resolución de fase reversa. Se realizó la validación evaluando los parámetros de especificidad, linealidad, precisión y exactitud, cumpliendo con las regulaciones vigentes en Cuba.
Resultados: el método analítico empleado para cada Ingrediente Activo Farmacéutico fue suficientemente específico, preciso y exacto para el objetivo propuesto, con una respuesta lineal en el rango de concentración de 50 a 150 %.
Conclusión: los métodos evaluados cumplen con el objetivo propuesto según exigencias regulatorias vigentes, por lo que puede emplearse para el control de calidad analítico de los Ingrediente Activo Farmacéutico estudiadas.

Palabras clave: cefalexina; cefaclor; cefoxitinasódica; cefixima; validación; cromatografía.

ABSTRACT

Introduction: Assuring good manufacturing practices, led by the need of validating the analytical methods to quantify the quality standards in the pharmaceutical raw materials, represents a key strategy for certification of the drug quality according to the regulatory guidelines of each country. For this paper, the authors selected cephalosporines which is a group of widely used antibiotics of low toxicity and broad therapeutic range.
Objective: To evaluate the performance of the analytical methods for quantification of the active ingredient to be used in the quality control of the Cuban-made cefalexin, cefaclor, sodium cefoxitin and cefixime.
Methods: Reversed phase, high performance liquid chromatography is applied in the quantification of pharmaceutical active ingredients. The validation was based on the specificity, linearity, precision and accuracy parameters in compliance with the present Cuban regulations.
Results: The analytical method for each pharmaceutical active ingredient was specific, precise and accurate for the above-mentioned objective, with a linear response within the 50-150% concentration range.
Conclusions: The evaluated methods met the set objective according to the present regulations, so they may be used in the analytical quality control of the studied pharmaceutical active ingredients.

Keywords: cephalexin, cefaclor, sodium cefoxitin, cefixime, validation, chromatography.

INTRODUCCIÓN

Las cefalosporinas pertenecen al grupo de los antibióticos β-lactámicos, que se obtienen semisintéticamente a partir de los cultivos de Cephalosporium acremonium. Son de amplio espectro y se indican para el tratamiento de un extenso conjunto de infecciones por gérmenes Gram positivos y Gram negativos; se utilizan además en la profilaxis de las infecciones perioperatorias.^1,2

Su estructura fundamental es el ácido aminocefalosporánico, que les confiere el carácter de ácidos débiles (figura 1).² Poseen un anillo β-lactámico fusionado con un anillo de dihidrotiazina de seis átomos, en lugar del anillo de tiazolina de cinco átomos, característico de las penicilinas. Las propiedades físicas y químicas de las cefalosporinas son similares a las de las penicilinas, aunque son algo más estables frente cambios de pH y temperatura.¹

Históricamente se les clasifica por generaciones según su espectro de actividad frente a bacterias Gram negativas. Las cefalosporinas de primera generación presentan una modesta actividad contra microorganismos Gram negativos en relación a la que presentan los de la tercera generación. En el primer grupo tenemos a la cefalexina, en la segunda generación podemos mencionar la cefoxitina sódica y el cefaclor, y en el grupo de la tercera generación se encuentra la cefixima. Cada una de ella tiene diferentes vías de administración y tiempos de vida media, por lo que alcanzan distintas concentraciones plasmáticas luego de su administración.

En lo que respecta al mecanismo de acción de las cefalosporinas, debe destacarse el papel principal de impedir la formación de la pared de la célula bacteriana inhibiendo la actividad de las transpeptidasas, enzimas que catalizan la formación de los enlaces peptídicos cruzados en la fase de unión de los polímeros de glucopéptido de la pared celular.^2,3,4

La cefalexina, la cefoxitina sódica, el cefaclor y la cefixima son medicamentos de amplia demanda en la práctica clínica por poseer escasa toxicidad y amplio margen terapéutico, por lo que es importante garantizar el cumplimiento de los estándares de calidad en cada una de las etapas del proceso de producción de estos productos farmacéuticos.

En la Regulación 61/2012, el Centro Estatal para el Control de los Medicamentos, Equipos y Dispositivos Médicos (CECMED), se plantea la obligatoriedad de realizar la validación de los métodos de análisis empleados en la cuantificación del IFA, ya sean métodos farmacopéicos o implementados por el fabricante.⁵

La validación puede definirse como "la confirmación mediante el examen y la aportación de evidencia objetiva de que se cumplen los requisitos para una utilización específica prevista".⁶ Es una de las medidas universalmente reconocidas como parte necesaria de todo sistema completo de garantía de calidad en laboratorios analíticos, estos requieren métodos analíticos confiables para cumplir con las normas nacionales e internacionales en todas las áreas de análisis. Algún grado de validación siempre es apropiado aun cuando se usan métodos de referencia publicados o aparentemente bien caracterizados.

Los procedimientos analíticos farmacopéicos no necesitan ser validados íntegramente pero si debe establecerse evidencias documentadas de aptitud en las condiciones reales, debe disponerse de evidencia que demuestre que tales metodologías son adecuadas para el uso rutinario en el laboratorio (verificación). Durante el proceso de verificación se utilizan algunas de las características del desempeño analítico del método, las que se consideren adecuadas de acuerdo a los parámetros establecidos en los estudios de validación. La selección de los parámetros a evaluar depende del tipo de procedimiento, del equipo e instrumentos asociados y de los objetivos a cumplir.^7,8

Existen numerosas técnicas analíticas descritas en la bibliografía para la cuantificación de cefalexina, cefaclor, cefoxitina sódica y cefixima, entre las que se pueden enumerar la electroforesis, la espectrofotometría, la espectrofluorometría y la cromatografía.^9-14

La cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) es la técnica de elección para demostrar la sensibilidad y la selectividad en productos terminados que contengan cefalosporinas.⁹

Uno de los requisitos que exigen los laboratorios de control de la calidad como parte de las Buenas Prácticas es contar con métodos validados, por lo que este trabajo se propuso como objetivo evaluar el desempeño de los método analíticos oficiales para la cuantificación del IFA en cuatro materias primas de cefalosporinas: cefalexina, cefaclor, cefoxitina sódica y cefixima.

MÉTODOS

MUESTRAS Y REACTIVOS

Se empleó como materia prima la cefalexina, cefaclor, cefoxitina sódica y cefixima proporcionada por la Empresa Farmacéutica "8 de Marzo" (La Habana, Cuba), procedente de la India y con un porciento de pureza mayor de 99 %.

Los disolventes y reactivos utilizados fueron de calidad CLAR (Merck, Alemania).

Se utilizó sustancia de referencia química de calidad USP (Estados Unidos) correspondiente a cada IFA con pureza mayor de 99 %.

EQUIPOS Y CONDICIONES ANALÍTICAS

Se empleó un cromatógrafo Knauer (Alemania), bomba isocrática, inyector automático con un volumen de inyección de 20 μL e integrador (SHIMADZU CR 8 A), detector UV modelo Knauer acoplados a una PC con el programa Biochrom (CIGB, Cuba). Se utilizó una columna LiChrosorb RP-18 encapada con tamaño de partícula de 5 μm, 4,6-mm × 25-cm; packing L1. El flujo fue 1,5 mL/min. La longitud de onda 254 nm, excepto para el cefaclor de 265 nm. Temperatura 30±5 ºC.

PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS, SUSTANCIA DE REFERENCIA QUÍMICA Y FASE MÓVIL

La preparación de la sustancia de referencia química y las muestras se corresponde con lo que se plantea en la farmacopea USP XXXVI, así como los sistemas de solventes empleados para cada compuestos,⁶ se utilizan mezclas indistintamente de diferentes solventes como acetonitrilo, agua, metanol, diferentes buffer y trietilamina, se controla el pH en cada solvente preparado, ajustándolo a las condiciones del laboratorio analítico del Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM).

La fase móvil para la cefalexina se preparó una mezcla de acetonitrilo, metanol, trietilamina y agua a pH 3,0 ajustado con ácido fosfórico; para el cefaclor se mezcló trietilamina, metanol, agua a un pH de 2,5 ajustado con ácido fosfórico, en la cefoxitina sódica la fase móvil se preparó a partir de agua, acetonitrilo, ácido acético glacial y buffer fosfato hasta obtener pH 7,1 y para la cefixima se preparó una mezcla de hidróxido tetrabutilamonio, acetonitrilo y agua ajustado con ácido fosfórico a pH 6,5.

EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DEL MÉTODO ANALÍTICO

La evaluación del desempeño del método se realizó teniendo en cuenta los lineamientos para la validación establecidos por la Conferencia Internacional de Armonización (ICH) y la farmacopea USP XXXVI^.6,9,15

A los valores obtenidos en cada ensayo se le determinó homogeneidad de varianza para demostrar el comportamiento normal de los datos y se procesaron a partir de métodos paramétricos como el ANOVA simple, Regresión Linear, utilizando el software estadístico Stagraphic plus versión 5.5.

Se analizaron los siguientes parámetros:

Selectividad: para demostrar que la señal obtenida correspondía únicamente al analito y no a impurezas o productos de degradación se sometieron las materias primas a diferentes condiciones drásticas: Temperatura 1 h por reflujo y luz solar durante 7 días, Hidrólisis ácida HCL 1 N, Hidrólisis básica NaOH 1 N y oxidación con H₂O₂durante 4 h a temperatura ambiente. Al final del ensayo todas las muestras se completaron a volumen con diluente utilizado para cada IFA según lo declarado en la farmacopea⁹ para alcanzar una concentración equivalente al 100 % de la concentración declarada para el medicamento. Cada una de las muestras degradadas fue inyectada para obtener cromatogramas independientes, así como las muestras sin degradar y las sustancias de referencia química USP.

Linealidad: la linealidad se evalúo por triplicado en muestras de la sustancia de referencia química de cada uno de los analitos a determinar, con diferentes niveles de concentración correspondientes a 50, 75, 100, 125 y 150 % de IFA. La evaluación de la linealidad se realizó a través de los coeficientes de correlación y regresión, la determinación del coeficiente de variación de los factores de respuesta y el nivel de significación del intercepto asumiendo una confianza del 95 %.

Precisión: la precisión se determinó a través de la evaluación de la repetibilidad y de la precisión intermedia donde se analizaron el coeficiente de variación. En el caso de la repetibilidad se realizaron nueve réplicas de materia prima a una concentración equivalente al 100 % de la concentración declarada para el medicamento. La precisión intermedia fue determinada a través de los resultados obtenidos para la misma muestra por dos analistas en dos días. Se evaluó mediante una comparación por ANOVA y prueba t Student con un nivel de confianza del 95 %.

Exactitud: fue establecida mediante el ensayo de recuperación a tres concentraciones diferentes 80, 100 y 120 %. Se emplearon tres réplicas en cada caso. Se determinó el porciento de recuperación, la desviación estándar y el coeficiente de variación. Se aplicó además el ensayo de Gochran (C) para evaluar si la variación de la concentración producía diferencias significativas en los resultados y la prueba de la t de Student para determinar diferencias significativas entre la recuperación media y el 100 %.

RESULTADOS

En las figuras 2, 3, 4 y 5 se observan los cromatogramas obtenidos para la sustancia de referencia química, la muestra y los productos de degradación de cada una de las cefalosporinas estudiadas: cefalexina, cefaclor, cefoxitina sódica y cefixima respectivamente. Se aprecia que no existe diferencia entre los tiempo de retención (tr) de la sustancia de referencia y de la muestra materia prima para cada uno de los analitos estudiados, además se puede observar que los tiempos de retención para cada uno de los productos de degradación de las IFAs difieren del tiempo de retención del producto de interés.

Los resultados estadísticos del estudio de linealidad para cada una de las metodologías empleadas en la cuantificación de las diferentes materias primas se muestran en la tabla 1.

En la tabla 2 se presentan los resultados del ensayo de repetibilidad, precisión intermedia y exactitud, donde se obtuvieron coeficientes de variación inferiores al 2 %, en cada caso.

Los valores demuestran que no existen diferencias estadísticamente significativas entre las medias obtenidas por ambos analistas y en los días estudiados, para un 95 % de probabilidad, dado por la prueba de varianza (F de Fisher) y la prueba de t de Student al obtenerse para ambos estadígrafos que el valor de p≥0,05.

El valor de porcentaje de recobro, en la exactitud, estuvo dentro de los límites permitidos para los métodos cromatográficos (98,0-102,0 %). Al realizar el ensayo de Gochran para una probabilidad de 0,05, k=3 y n=3 y la prueba de significación entre la recuperación media y el 100 % de recuperación, se obtuvieron resultados satisfactorios de acuerdo a los criterios establecidos.

DISCUSIÓN

Las cefalosporinas estructuralmente se caracterizan por la presencia del ácido aminocefalosporánico, el que les confiere a estas sustancias su carácter de ácidos débiles. Son de naturaleza polar, no volátil y termosensibles, características que han hecho posible la preferencia de métodos CLAR para la cuantificación de este grupo funcional.⁹

En los estudios de selectividad se somete al fármaco a factores que afectan la estabilidad, para obtener posibles productos de degradación y determinar las condiciones óptimas en las que se pueda determinar el IFA en presencia de los mismos sin interferencias.

Los cromatogramas para cada estructura demuestran la equivalencia en cuanto a los tiempos de retención del pico correspondiente para la sustancia de referencia química y las muestras analizadas para cada IFA. La cefalexina presenta tr próximo a 4,33 min, mientras que el cefaclor presenta tr a 6,35 min, así como tr cercano a 6,90 min para la cefixima. En el caso de la cefoxitina sódica la muestra presenta un tiempo de retención alrededor de 7,33 min, el cual difiere de la sustancia de referencia química (tr=7,57 min) esta diferencia podría estar dada por un efecto matriz o por desestabilización de la tensión eléctrica al iniciar la corrida.

De manera general se puede observar que estos IFAs se degradan en las condiciones expuestas, pues sufren pérdida del área del pico en más de un 15 %. En los cromatogramas se demuestra la selectividad de la técnica empleada, teniendo en cuenta que los tiempos de retención de los productos de degradación difieren del tiempo de retención del pico de las muestras. En algunos casos, a pesar que se obtuvo evidencia de la degradación por oxidación, no se pudo constatar cromatográficamente la degradación de la luz, de la cual se conoce que está asociada comúnmente a reacciones de tipo oxidativas. Por otra parte, es conocida la degradación de las cefalosporinas por hidrólisis debido a la ruptura del radical ácido que se encuentra unido al grupo amino del ácido 6-aminopenicilánico, así como por el ataque nucleofílico del grupo carbonilo del anillo β-lactámico que provoca la ruptura de este anillo.¹⁶

La cefalexina presenta alta solubilidad y permeabilidad por ser una molécula que se absorbe en el tracto gastrointestinal mediante mecanismos mediados por carrier.^17,18 Son las de mayor actividad contranGram positivos y Gram negativas, como Pasteurella y Salmonella. También son sensibles a muchas bacterias anaerobias. Se observa una degradación alta por hidrólisis de la cefalexina, igualmente se obtuvieron picos correspondientes a productos de degradación por temperatura a dos tr: 2,42; 3,67 min y por oxidación en el tr 1,17 min, en ninguno de los cromatogramas interfieren estos productos con el tiempo de retención del IFA sin degradar, lo cual demuestra la selectividad del método empleado.

El cefaclor o ácido 3-cloro-7-D-(fenilglicinamido)-3-cefem-4-carboxílico monohidratado, es un antibiótico cefalosporínico semisintético, indicado para el tratamiento de infecciones causadas por cepas sensibles de numerosos microorganismos, especialmente estreptococos y estafilococos, posee dos grupos ionizados con pKa=1,5 y 7,17 que se corresponde a la disociación del grupo carboxi y α-amino, respectivamente. ¹⁹ Las formas farmacéuticas actualmente disponibles de administración de cefaclor comprenden cápsulas, comprimidos de acción retardada y suspensiones tanto en frasco como en sobres. Se observa una disminución del área del pico del IFA por termólisis y por hidrolisis básica, lo cual indica que el compuesto en estas condiciones experimentó modificaciones estructurales, lo cual se corresponde con otras literaturas científicas, las cuales plantean que uno de los posibles mecanismos de degradación es el ataque intramolecular del grupo NH ₂ en el carbono de la posición 7 de la cadena lateral del anillo β-lactámico frente a la hidrólisis, sin embargo en termólisis se puede adicionar la pérdida del ión Cl al abrirse la estructura del anillo β-lactámico.^20,21 Se puede apreciar que en el caso de la hidrólisis ácida y la oxidación el IFA es susceptible a estas condiciones degradativas por la presencia de productos de degradación que eluyen antes del tr del cefaclor.

La cefoxitina sódica es una cefamicina activa fundamentalmente sobre bacterias anaerobias, dado por el grupo α-metoxi en la posición 7 del anillo β-lactámico que hace que presenten mayor resistencia a la hidrólisis por β-lactamasas estafilocócicas y las producidas por bacterias aerobias y anaerobias.

Otra observación es que los productos de degradación no interfieren con el pico atribuible a la muestra de cefoxitina sódica en las condiciones de oxidación, termólisis e hidrólisis, estas reacciones de degradación constituyen las principales rutas degradativas de este compuesto.¹⁰

La cefixima es un antibiótico cefalosporánico semisintético de administración oral, el cual posee mejor actividad para combatir las bacterias Gram negativas que otras drogas de referencia como la cefalexina, el cefaclor y la amoxicilina, es utilizado en el tratamiento de la otitis media, faringitis, de las infecciones urinarias y del tracto respiratorio. Durante el estudio de la cefixima, también se demostró la selectividad del método frente a los posibles productos de degradación en las diferentes condiciones estresantes, en las cuales se observa disminución del IFA sin degradar. Lo cual coincide con lo planteado por González R, que describió a pH ácido la aparición de tres productos de degradación, donde ocurre la formación de tres g-lactonas debida a la lactonización inicial entre los grupos vinílicos y los grupos carboxílicos vecinos.²²La ruptura del anillo β-lactámico se debe a la protonación del mismo en un medio ácido y es seguido por la ruptura del anillo cefalosporánico. En el medio básico se reportan dos productos de degradación, considerada como el resultado de la ruptura del anillo β-lactámico, producida por el ataque nucleofílico del ión hidroxilo sobre el grupo carbonilo del anillo β-lactámico, seguido por el reagrupamiento de los enlaces olefínicos. Por termólisis se obtiene un producto de degradación a un tr 1,35 min, sin embargo en oxidación aparece a 4,27 min, en los otros medios de degradación a pesar de que hay disminución en más de un 15 % respecto a los picos de la muestra sin degradar no se observan estos picos.

De acuerdo con los resultados obtenidos en el ensayo de linealidad, se pudo afirmar la existencia de una correlación linealmente positiva entre los valores de concentración escogidos y las respuestas obtenidas, al alcanzar coeficientes de correlación y determinación superior a 0,99. Se comprueba que el intervalo de confianza del intercepto incluye al cero para el 95 % de confiabilidad.

Cuando se aplicó la prueba de linealidad mediante el coeficiente de variación de los factores de respuesta, se obtuvo como resultado, un CVf inferior al 5 % lo que demuestra una adecuada linealidad de acuerdo al límite establecido

En el ensayo de precisión se obtuvieron coeficientes de variación para la repetibilidad y la reproducibilidad inferiores al 2 % respectivamente, valor establecido como límite en la literatura para métodos cromatográficos. En la prueba de homogeneidad de varianza, durante la precisión intermedia la probabilidad asociada con el valor de F fue mayor que 0,05 en todos los casos; por lo que se puede afirmar que no existen diferencias estadísticamente significativas entre los análisis realizados por los analistas.

Los resultados del estudio de exactitud permiten asegurar que el método es exacto para determinar la concentración de la materia prima, ya que en la comparación del valor medio de recobro y del valor real por una prueba t de Student demostró que el valor de t_exp es menor que el valor de t_tab (2,571), por lo que no existen diferencias significativas entre lo obtenido experimentalmente y la concentración teórica (100 %). Además se demostró que el intervalo de confianza incluye al 100 %.

CONFLICTO DE INTERESES

No declarado por los autores

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Recibido: 13 de julio de 2015
Aprobado: 19 de febrero de 2016

Lisandra García Borges. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). Ave 26 Ave. 26 No. 1605 entre Puentes Grandes y Boyeros. Plaza de la Revolución. La Habana, Cuba. Teléfono: 78708083. Dirección electrónica: lisandra.garcia@cidem.sld.cu

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