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PRODUCTOS NATURALES
Validación de un método de análisis por cromatografía líquida de alta resolución para determinar quercetina en Allium shoenoprasum Regel & Tiling (cebollín)
Validation of an analysis method through high performance liquid chromatography for determination of quercetin in Allium shoenoprasum Regel &Tiling (chives)
Oswaldo Guillermo Pesantes Domínguez,I Katherine Elizabeth Bustamante Pesantes,I Migdalia Miranda Martínez,I Viviana García MirII
I
Facultad de Ciencias Químicas. Universidad de Guayaquil. Ciudadela Universitaria
"Salvador Allende". Guayaquil, Ecuador.
II
Universidad Técnica de Machala. Ecuador.
RESUMEN
Introducción:
las especies del género Allium como la cebolla, el ajo, el
puerro y el cebollino son reconocidos por sus usos populares en la mayoría
de las farmacopeas tradicionales de todo el mundo. De las especies de este género,
Allium schoenoprasum L (cebollino) ha sido poco estudiada, especialmente
desde el punto de vista farmacognóstico. En un estudio por HPLC y espectrometría
de masa llevado a cabo por Ulla (2001), se encontró en extractos de la
especie, quercetina, kaempferol e isorhamnetin en el orden de los 3, 12 y 5
mg/100 g de peso fresco.
Objetivo:
validar un método analítico por cromatografía líquida de
alta precisión (HPLC) para cuantificar quercetina en extracto de Allium
schoenoprasum.
Métodos:
para el estudio se utilizó un cromatógrafo líquido KNAVER,
bajo las siguientes condiciones de trabajo: fase móvil solución de
buffer fosfato pH=2,4: acetonitrilo (70:30); temperatura del horno: 25 °C;
detector: KNAVER por arreglo de diodo, 370 nm (200-400); flujo a 0,9mL/min;
volumen de inyección 20μL; columna Uptisphere 5 0DB 708 965
(RP-18).
Resultados:
el método validado resultó lineal, preciso, exacto y específico.
Conclusiones:
el método es simple y fiable, y puede ser utilizado para el control de
la calidad de Allium schoenoprasum L (cebollino) y sus preparaciones.
Palabra Clave: Allium schoenoprasum L (cebollino); validación de métodos análisis; HPLC.
ABSTRACT
Introduction:
Allium genus species such as onions, garlic, leeks and chives are
known for being widely used in most traditional pharmacopeia worldwide. Among
these genus species, Allium schoenoprasum L (chives) has been barely
studied, especially from the pharmacognostic point of view. In a study using
high performance liquid chromatography and mass spectrometry conducted by Ulla
(2001), there were found quercetin, kaempferol and isorhamnetin weighing 3,
12 and 5 mg/100 g in the species extracts.
Objective:To
validate an analytical method through high performance liquid chromatography
(HPLC) to quantify quercetin in Allium schoenoprasum extract.
Methods:
for the study, the KNAVER liquid chromatograph was used under the
following working conditions: mobile phase phosphate buffer solution pH=2.4:
acetonitrile (70:30); oven temperature set at 25 ° C; detector called KNAVER
by diode array, 370 nm (200-400); flow at 0.9mL/min; 20μL injection volume;
Uptisphere 5 708 965 0DB column (RP-18).
Results:
The validated method was linear, precise, accurate and specific.
Conclusions:
This method is simple and reliable and can be used for quality control
of Allium schoenoprasumL(chive) and their preparations.
Keywords: Allium schoenoprasum L (chives); validation of analysis methods; HPLC.
INTRODUCCIÓN
Allium schoenoprasum L., conocido como cebollino (en castellano), es nativa de Europa, Asia y América; se encuentra en los condados norteños y occidentales de Inglaterra, Gales y en Oxfordschire.1-3
Las especies del género Allium presentan gran utilidad para el hombre, ya que se pueden encontrar un gran número de ellas con propiedades medicinales, otras como ornamentales, comestibles y con aplicaciones industriales, destacándose el consumo popular en China, India, África, Brasil, Europa, así como en regiones tropicales y templadas.4-6
En el caso particular de Allium schoenoprasum L., las partes empleadas de la planta son las hojas y bulbos, preferentemente las primeras, utilizadas como verduras, para sazonar sopas, ensaladas y en estofados. En la medicina tradicional de la India se le otroga el mismo uso que a Allium cepa L., de tal forma que es utilizada frente a la disentería, diarreas y flatulencias, como afrodisíaco, estimulante, emenagogo, expectorante y diurético.7,8
En cuanto a la composición química, no existe mucha información. Un estudio por HPLC y espectrometría de masas, encontró en extractos de la especie, quercetina, kaempferol e isorhamnetin.9-11 Otros autores reportan en términos generales para la especie la presencia de flavonas, flavanonas y flavonoles, así como tiosulfinatos.12-17
MÉTODOS
Para la determinación de flavonoides se elaboró un extracto por maceración con etanol al 80 % a partir de las hojas y los bulbos; se partió de 500 g de material vegetal seco en un litro de disolvente. El tiempo de extracción fue de siete días con agitación frecuente. El extracto obtenido se llevó a sequedad en rotoevaporador a vacío y se extrajo de forma sucesiva con éter de petróleo 30-40 ° y una vez filtrado y evaporado este disolvente, se extrajo con metanol. El extracto metanólico concentrado a un volumen de 50 mL, fue empleado para la validación.
El método por HPLC se validó teniendo en cuenta las metodologías y criterios de aceptación planteados en la literatura.18,19 Se determinaron algunos parámetros como linealidad, precisión, exactitud y especificidad. En la comprobación de la linealidad se procedió a realizar una curva de calibración de área vs concentración de la sustancia de referencia (quercetina) en el orden de 8, 12, 16, 20 y 25 ppm. Para definir la linealidad del método se determinaron los coeficientes de correlación r (>0,99); coeficiente de determinación r2 (>0,99), factor de respuesta f cuyo coeficiente de variación (CV) debe ser <5 %; significación estadística de la varianza de la pendiente a través de t student donde el valor de texperimental debe ser mayor que t tabulada y test de proporcionalidad para el intercepto donde texperimental debe ser menor que ttabulada.
La precisión se evaluó en términos de repetibilidad y precisión intermedia. Para la repetibilidad se utilizó un diseño a un nivel de concentración de la muestra (100 %) y se realizaron 10 determinaciones. El coeficiente de variación debe ser menor del 2 %. Para determinar la precisión intermedia, se efectuó con un solo nivel de concentración de la muestra equivalente al 100 %, por quintuplicado, por diferentes analistas y días diferentes. Se realizó una prueba de Fischer para determinar si existían diferencias significativas entre la precisión alcanzada por los analistas y un test de student para determinar si existían diferencias significativas entre las medias alcanzadas por los analistas. Como criterio se exige que el coeficiente de variación (CV) sea ≤2 %.
En el análisis de exactitud se utilizó un diseño similar al de linealidad, pero empleando tres niveles de concentraciones (bajo, medio y alto), cada uno por triplicado y se desarrolló el método propuesto.
Se determinó el porcentaje de recobro (R) y el coeficiente de variación. Se calculó R por la expresión siguiente:
Se procesó estadísticamente la relación entre las concentraciones medidas y añadidas, a través de una curva de recuperación.
Para que el método sea exacto, no deben existir diferencias significativas entre el valor del recobrado medio y el 100% y el coeficiente de variación debe ser ≤2%.
Para demostrar la exactitud del método, se sometió 10 mL de la muestra a hidrólisis ácida con ácido clorhídrico al 1N (10 mL) y se reflujó por 2 h, la solución resultante se inyectó en el equipo y se desarrolló el método, obteniendo el cromatograma correspondiente para analizar si existía solapamiento o no entre el compuesto de interés (quercetina) y sus productos de degradación.
Los parámetros de validación se procesaron matemáticamente utilizando el paquete estadístico STATGRAPHIC Plus 15.0.
RESULTADOS
En el estudio de linealidad se obtuvo la recta de mejor ajuste, siendo su ecuación Y=77,2908X+24,2250, donde Y es el valor del área bajo la curva y X la concentración de quercetina. Se obtuvo un valor de coeficiente de correlación (r) de 0,9994 (r>0,99) y r2=0.9988 (>0,98), lo cual demuestra que existe una buena correlación entre la concentración y la respuesta. El coeficiente de variación de los factores de respuesta (Cvf) igual a 1,84 % cuyo valor es aceptable por ser menor del 5 %. En la significación estadística de la pendiente de la recta de regresión t experimental (tr) es mayor que ttabulada (51,74>3,18) con una desviación estándar relativa (DSR o CV) menor del 2 %, o sea, 1,49 %.
En el test de proporcionalidad para el intercepto el valor de t experimental (ta) (0,93) fue menor que el ttabulada (3,18).
Los resultados (tabla 1) permiten concluir que el método es lineal en el rango de concentraciones evaluadas, pues existe una buena correlación entre las concentraciones ensayadas y las respuestas obtenidas.
La precisión fue otro parámetro analizado como repetibilidad y precisión intermedia, y se expresa matemáticamente por el coeficiente de variación. Los resultados del estudio se representan en las tablas 2, 3 y 4.
Los resultados del estudio de repetibilidad mostraron que el ensayo cumple con el requisito establecido de ser menor e igual del 2 %.
El ensayo de precisión intermedia evidenció que no existen diferencias significativas entre las precisiones alcanzadas por los dos analistas al efectuarse la prueba de significación de Fischer, siendo Fcalculada<Ftabulada.
Una vez demostrada que las precisiones eran similares, se aplicó una prueba t student mediante la cual se determinó que no existen diferencias significativas entre las medias alcanzadas por los analistas al ser ttabulada>texperimental.
Por su parte los resultados del estudio de exactitud (tabla 4) muestran un recobrado entre 97-103 % con coeficientes de variación ≤2 % y el test de significación para un nivel de confianza de P=0,05 con n-1 grados de libertad demostró que no hubo diferencias significativas entre el recobrado medio y el valor aceptado por la literatura, al ser ttabulada>texperimental (4,30>0,38).
En el análisis de exactitud se utilizó un diseño similar al de linealidad pero empleando tres niveles de concentraciones. La curva obtenida se muestra en la figura 1.
Finalmente fue desarrollado el parámetro de especificidad, obteniendo como resultados que el método cumple con dicho requisito al no encontrarse solapamiento entre el pico correspondiente a la quercetina y sus productos de degradación cuando la muestra es sometida a hidrólisis ácida (figura 2).
DISCUSIÓN
Los resultados manifestaron la linealidad del método propuesto. La curva de calibración obtenida se comportó de forma lineal en el rango de concentraciones evaluadas, cumpliendo con la ley de Lambert-Beer; se obtuvieron coeficientes de correlación lineal (r) y de determinación (r2) superiores a los exigidos, existiendo una correlación con un grado de probabilidad elevada, así como un grado de relación entre las variables concentración y respuesta detectada por el equipo empleado, al ser r cercano a la unidad.18,19
Al aplicarse el test de Student, los valores experimentales obtenidos cumplen con el criterio de aceptación para el intercepto. El valor medio del coeficiente de respuesta obtenido demuestra que está cercano al valor de la pendiente de la recta y el valor del coeficiente de variación de los factores de respuesta resultó ser menor que 5 %, esto demuestra que el método establecido cumple con los parámetros de linealidad.
El estudio de la precisión demostró que en ambos casos los resultados analíticos cumplen con el límite establecido para el coeficiente de variación de métodos cromatográficos, el cual debe ser menor e igual que 2 %; esto demuestra que el método es repetible. Mientras que, al cumplirse los criterios de aceptación necesarios se comprueba que no existen diferencias significativas entre las dispersiones, ni entre las medias de ambos analistas, por lo tanto, puede asumirse que existe homogeneidad en los datos obtenidos y de esta forma se demuestra que el método es reproducible.
En el caso del estudio de la exactitud es de resaltar que en todos los casos se obtuvo un coeficiente de variación menor que 2 %, los porcentajes de recuperación entre 98 y 102 %, que cumple lo establecido en la literatura. Se comprobó, además, que no existen diferencias significativas entre la recuperación media y 100 % de recobro, también que las varianzas de las concentraciones son equivalentes; por lo tanto, puede asumirse que la concentración no influye en la variabilidad de los resultados.
Por todo lo anterior, se puede afirmar que el método desarrollado es lineal, preciso, exacto yespecífico, por lo que puede ser empleado para la cuantificación de quecetina en extractos de cebollino.
CONFLICTO DE INTERESES
No declarado por los autores
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Recibe: 18 de octubre
de 2015
Aprueba: 23 de enero de 2016
Oswaldo Guillermo Pesantes Domínguez. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad de Guayaquil. Ciudadela Universitaria "Salvador Allende". Ave. Kennedy S/N y Av. Delta. Guayaquil, Ecuador. Teléfono: 593-2293680/2293379. Dirección electrónica: oswaldopesantes@yahoo.com
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