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PRODUCTOS NATURALES
Actividad antifúngica in vitro de ocho extractos de invertebrados marinos frente a Candida spp.
In vitro antifungal activity of eight extracts from marine invertebrates against Candida spp.
Rosario Esperanza Velar Martínez, María Teresa Illnait-Zaragozí, Aneisy Pérez Hernández, Lianet Monzote Fidalgo
Departamento de Bacteriología-Micología. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". La Habana, Cuba.
RESUMEN
Introducción: la incidencia creciente
de las infecciones causadas por el género Candida y su resistencia
a los fármacos antifúngicos disponibles, ha conllevado a la
búsqueda de nuevas sustancias más seguras y eficaces que las existentes.
Los invertebrados marinos se usan de forma exitosa como fuente de moléculas
activas con aplicaciones terapéuticas.
Objetivo: evaluar la actividad antifúngica
de ocho extractos crudos de invertebrados marinos de Cuba (Bartholomea annulata,
Cassiopea xamachana, Echinometra lucunter, Hermodice carunculata, Physalia
physalis, Protopalythoa variabilis, Sabellastarte magnifica y Tripneustes
ventricosus).
Métodos: se enfrentaron a Candida
albicans ATCC 10231 y Candida parapsilosis ATCC 22019 (0,5-2,25 ×
103 UFC/mL, diluciones seriadas de cada extracto (6,25; 12,5; 25;
50 y 100 µg/mL) mediante el método de microdilución acorde al
Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio modificado con MTT
(5 mg/mL). Se determinó la concentración mínima inhibitoria (CMI)
y concentración inhibitoria media (CI 50).
Resultados: todos los extractos evaluados
presentaron actividad antifúngica, con valores de CMI y CI50
≤ 50 µg/mL. El extracto de T. ventricosus con una menor concentración
de 8,6 ± 2,8 μg/mL fue capaz de lograr 50 % de inhibición frente
a C. albicans.
Conclusiones: estos resultados demuestran
el potente efecto de T. ventricosus, el cual pudiera explorarse para
el desarrollo de una opción terapeútica en el tratamiento anti-candidiásico.
Estudios futuros pudieran ayudar a definir otras especies susceptibles y los
compuestos responsables de su actividad antifúngica.
Palabras claves: extractos naturales; invertebrados marinos; Tripneustes ventricosus; Candida; actividad antifúngica.
ABSTRACT
Introduction: The growing incidence of
the infection due to Candida genus and its resistance to the available
antifungal drugs has led to search for safer and more effective substances than
the existing ones. Marine invertebrates have been successfully used as source
of active molecules with therapeutic applications.
Objectives: To evaluate the antifungal
activity of crude extracts from eight Cuban marine invertebrates ( Bartholomea
annulata, Cassiopea xamachana, Echinometra lucunter, Hermodice carunculata,
Physalia physalis, Protopalythoa variabilis, Sabellastarte magnifica and
Tripneustes ventricosus).
Methods: Serial dilutions of every extract
(6.25, 12.5, 25, 50 and 100 µg/mL) by broth microdilution method, according
to The Institute of Clinical and Laboratory Standards modified with MTT (5 mg/mL),
were applied against Candida albicans ATCC 10231 and Candida parapsilosis
ATCC 22019 (0.5-2.25 × 103 UFC/mL). Minimum inhibitory concentration
(MIC) and mean inhibitory concentration (IC50) were estimated.
Results: All the studied products showed
antifungal activity with MIC and IC50 equal to or lower than 50 µg/mL.
Extract from T. ventricosus with a low concentration of 8.6 ± 2.8
μg/mL could reach 50 % inhibition against C. albicans.
Conclusions: These results show the potent
antifungal effect of T. ventricosus, which can be explored for the development
of a therapeutic option in anti-candidiasis responsible for the antifungal activity.
Keywords: Natural extract; marine invertebrates;Tripneustes ventricosus; Candida; antifungal activity.
INTRODUCCIÓN
El incremento de las infecciones fúngicas en todo el mundo, unido al desarrollo de mecanismos de resistencia primaria y secundaria, han ejercido una gran influencia en la investigación y búsqueda de medicamentos más eficaces e inocuos. Cada año se reportan tasas crecientes de morbimortalidad debido a infecciones por Candida; las que a su vez se asocian a elevadas cargas de resistencia a los medicamentos disponibles.1,2 Esta situación ha despertado el interés de numerosos investigadores por los productos naturales, como fuente de nuevos y variados agentes antimicóticos.3
Cuba posee una gran biodiversidad de los mares, lo que representa un potencial como fuente de metabolitos bioactivos por explorar. Hasta la fecha, el número de invertebrados marinos registrados en su plataforma sobrepasa la cifra de 5 700 especies.4 Si bien las esponjas son la principal fuente de compuestos biológicamente activos dentro de los invertebrados marinos, otros organismos menos estudiados pudieran tener actividad antimicrobiana.5 El objetivo de este trabajo fue evaluar la actividad antifúngica de ocho extractos hidroalcohólicos de invertebrados marinos con la finalidad de identificar aquellos con potencial bioactivo contra Candida.
MÉTODOS
CEPAS
Se emplearon las cepas Candida albicans ATCC 10231 y Candida parapsilosis ATCC 22019, disponibles en la Micoteca del Laboratorio de Micología del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Estas se encontraban conservadas en agua destilada estéril a 28 °C.
ORGANISMOS
Se utilizaron organismos marinos pertenecientes al grupo de los invertebrados. En el cuadro se exponen las especies utilizadas, familia a la que pertenecen, fecha de colecta y número de espécimen. En su mayoría fueron colectados en el litoral de La Habana en zonas aledañas al Acuario Nacional de Cuba, excepto Cassiopea xamachana y Physalia physalis, procedentes de la localidad de Santa Fe, La Habana.
PREPARACIÓN DE LOS EXTRACTOS
Se empleó el cuerpo de las especies de invertebrados marinos colectados excepto en el caso de Echinometra lucunter y Tripneustes ventricosus donde se utilizó la parte interna de ellos para elaborar los extractos. Cada muestra se suspendió en etanol al 80 %, se sometió a maceración y fueron incubadas 7 días a 4ºC con agitación tres veces al día por 1 minuto. Posteriormente, se filtraron por gasa para eliminar los residuos de los organanismos utilizados y se liofilizaron. El polvo obtenido de cada muestra fue disuelto a una concentración de 20 mg/mL en dimetilsulfóxido (DMSO) para realizar las evaluaciones biológicas.
FÁRMACO DE REFERENCIA
Se empleó fluconazol (Sigma-Aldrich, Co., MO, EUA, a las concentraciones establecidas para las cepas utilizadas por el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI, del inglés Clinical and Laboratory Standards Institute).6 El criterio de susceptibilidad al fluconazol de Candida spp. está basado en un valor de concentración mínima inhibitoria (CMI) ≤ 8 µg/mL.
ENSAYO ANTIFÚNGICO
Se realizó un método de microdilución en caldo basado en el protocolo M27-A3 para levaduras del CLSI.6 La concentración inicial de los extractos se ajustó a 200 µg/mL en DMSO. Se realizaron diluciones dobles seriadas hasta obtener concentraciones entre 6,25 y 100 µg/mL en el medio de cultivo RPMI-1640 con glutamina y sin bicarbonato sódico tamponado con ácido 3-[N-morfolino] propanosulfónico (MOPS) (Sigma-Aldrich, EUA), ajustado a pH 7,0 ± 0,1 y con 0,2 % de glucosa. Las suspensiones se prepararon a una densidad correspondiente a la escala 0,5 de McFarland y se ajustó hasta obtener un inóculo final de 1 - 5 × 103 UFC/mL. Se incluyó un control de crecimiento (cultivo en RPMI-1640 libre de extracto) y un control de esterilidad (solo medio de cultivo RPMI-1640). La placa se incubó a 37°C por 48 h. La actividad se determinó mediante un método colorimétrico usando una solución de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2,5-difeniltetrazolio) (MTT, SIGMA, St. Louis, MO, EUA) a 5 mg/mL según lo propuesto por Hansen y colaboradores.7 La absorbancia se determinó a 560 nm en un lector de Elisa MRX Revelation (Dynex Technologies, EUA) y se utilizó como referencia el filtro de 630 nm. Los resultados se expresaron como CMI y concentración inhibitoria media (CI50). La concentración más baja a la que no se produjo el cambio de color se tomó como el valor de la CMI, se reportó el promedio de tres experimentos realizados por separado. Se consideraron activos aquellos extractos que exhibieron una CI50 ≤ 100 µg/mL.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
La CI50 para cada extracto se obtuvo por análisis de regresión lineal acorde las curvas de dosis-respuesta. Los resultados fueron expresados como la media ± la desviación estándar de tres réplicas independientes. Se aplicó la prueba no paramétrica de Mann-Whitney mediante el programa STATISTIC para Windows, Versión 4.5, 1993 para una significación de p< 0,05.
RESULTADOS
En la tabla, se muestran los resultados obtenidos de la evaluación de la actividad anti-Candida de los extractos en estudio. En todos los casos, la CMI resultó inferior a la máxima concentración de los extractos probada y mostró valores ≤ 50 µg/mL frente a ambas cepas. De acuerdo a los valores de CI50, el extracto que mostró mayor actividad antifúngica frente a C. albicans fue el obtenido a partir de T. ventricosus. Los extractos de S. magnifica y P. variabilis resultaron los de menor actividad independientemente de la especie de Candida empleada.
Los valores de CI50 del fluconazol
frente a ambas cepas de levadura (C. albicans= 8,0 µg/mL y C.
parapsilosis= 2,0 µg/mL), sugieren que estas se comportan como sensibles
al fármaco según lo dictado por el CLSI6 para los
estudios in vitro. El valor de CI50 obtenido del extracto
de T. ventricosus, frente a C. albicans (CI50=
8,6 ± 2,8 µg/mL), fue similar al fármaco de referencia (p=
0,621). Sin embargo, frente a C. parapsilosis mostró cifras superiores
(CI50= 17,4 ± 0,6 µg/mL).
DISCUSIÓN
Numerosos extractos obtenidos a partir de invertebrados marinos como esponjas, algas, octocorales y moluscos han hecho evidente su efecto inhibidor frente a Candida. Entre ellos se encuentran los de las algas Rhodomela confervoides y Padina pavonica, las cuales han mostrado potente actividad frente a la especie de mayor relevancia clínica de esta especie, C. albicans.8-10 También se han obtenido resultados prometedores con preparados a partir de los equinodermos Holothuria floridana y Luidia maculata,11,12 lo que corrobora la potencialidad de los invertebrados marinos como fuentes potenciales de metabolitos activos frente a este hongo levaduriforme.
Cos y otros plantean como criterio de actividad selectiva antimicrobiana para un extracto crudo la inhibición del 50 % del crecimiento del microorganismo frente a concentraciones ≤ 100 µg/mL del producto en cuestión.13 Según este criterio, los extractos evaluados en el presente estudio muestran buena actividad anti-Candida. El hecho que la CMI de un fármaco convencional exhiba valores inferiores a las arrojadas por los extractos, incluyendo el de T. ventricosus, pudiera deberse a que no se evaluaron principios activos purificados. En su lugar, los compuestos bioactivos que forman parte de la mezcla de sustancias que conforman cada extracto crudo, se encuentran posiblemente en proporciones inferiores a las ajustadas en este caso.
Los resultados de este estudio resultan importantes si se tiene en cuenta la creciente incidencia de resistencia clínica en el curso de la candidiasis a los medicamentos antifúngicos disponibles, especialmente frente al fluconazol.14 Esta realidad ha obligado a la búsqueda intensiva de nuevos metabolitos con actividad antimicótica.
T. ventricosus es uno de los 63 equinoideos registrados en Cuba. Habita en profundidades menores a 30 m y se encuentra en abundancia en el litoral rocoso de Cuba.15 En la literatura revisada se reporta el efecto antibacteriano y antiviral de otras especies del mismo género.16,17 Sin embargo, no se encontraron evidencias documentales sobre la actividad antimicrobiana del espécimen en cuestión. El presente trabajo constituye la primera evidencia del efecto antifúngico relacionado con T. ventricosus.
Se conoce que los equinodermos producen compuestos químicos de amplio interés farmacológico, principalmente saponinas y asterosaponinas, las cuales exhiben un amplio espectro de actividad entre las que se destacan la citotóxica, antibacteriana y antifúngica, entre otras.15,18 Las saponinas son capaces de formar poros en la membrana lipídica e incrementar la permeabilidad celular de las células fúngicas, impiden la formación de biopelículas en C. albicans e interactúan con los esteroles de la membrana.19,20
De manera general, los extractos evaluados sugieren una promisoria actividad anti-Candida, en particular el obtenido a partir de T. ventricosus. Este resultado permite sugerir que se profundice en los estudios de susceptibilidad in vitro de las fracciones purificadas de estos. También en su evaluación frente a especies fúngicas diferentes de C. albicans y C. parapsilosis.
AGRADECIMIENTOS
Al colectivo del Laboratorio de Micología del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"; en especial al Dr. MSc. Gerardo F. Martínez Machín, al Lic. DrC. Carlos M. Fernández Andreu, y la Lic. MSc. Mayda R. Perurena Lancha, por sus valiosos aportes a la realización de este trabajo.
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Recibido: 1 de febrero de 2016.
Aprobado:19 de julio de 2016.
Rosario Esperanza Velar Martínez.
Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK). La Habana,
Cuba.
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