Taninos aislados de la corteza de Excoecaria lucida Sw. (Aité) (Euphorbiaceae)

Julio César Escalona Arranz; Ania Ochoa Pacheco; Yuri Mangueira Do Nascimento; Vicente Carlos de Oliveira Costa; Josean Fechine Tavares; Marcelo Sobral Da Silva

Taninos aislados de la corteza de Excoecaria lucida Sw. (Aité) (Euphorbiaceae)

PRODUCTOS NATURALES

Taninos aislados de la corteza de Excoecaria lucida Sw. (Aité) (Euphorbiaceae)

Tannins isolated from the bark of Excoecaria lucida Sw. (Aité) (Euphorbiaceae)

Julio César Escalona Arranz¹Ania Ochoa Pacheco²
Yuri Mangueira Do Nascimento²
Vicente Carlos de Oliveira Costa²
Josean Fechine Tavares²
Marcelo Sobral Da Silva²

¹ Departamento de Farmacia. Facultad de Ciencias Naturales y Exactas. Universidad de Oriente. Santiago de Cuba, Cuba.
² Programa de Postgraduación en Productos Naturales y Sintéticos Bioactivos. Instituto de Ciencias de la Salud. Universidad Federal de Paraíba. Joao Pessoa, Brasil.

RESUMEN

Introducción: Excoecaria lucida Sw. (Aité) (Euphorbiaceae) es una especie utilizada por la población cubana con fines medicinales. Sin embargo, existe una insuficiente información científica que sustente sus usos tradicionales y composición química, por lo que se precisa la realización de estudios químicos y farmacológicos.
Objetivos: Aislar e identificar estructuralmente compuestos presentes en la corteza de la especie Excoecaria lucida Sw. (Aité) (Euphorbiaceae).
Métodos: El aislamiento e identificación estructural de los compuestos presentes en la corteza se llevó a cabo mediante cromatografía en columna con gel de sílica-60 como fase estacionaria, con la posterior utilización de técnicas espectroscópicas, como espectroscopía infrarroja y de resonancia magnética nuclear ¹H y ¹³C uni y bidimensional, correlación heteronuclear múltiple cuántica, correlación heteronuclear a múltiples enlaces, espectroscopía de correlaciones, y espectroscopía de efecto nuclear overhauser.
Resultados: Se aislaron e identificaron estructuralmente los taninos ácido 3,3'-di-O-metilelágico y ácido 3,3'-di-O-metilelágico-4'-O-D-xilopiranósido.
Conclusiones: Estos taninos derivados del ácido elágico, para la especie E. lucida Sw. y el género Excoecaria, se lograron identificar y aislar de la corteza por vez primera, lo que permite disponer de información sobre la composición química de este órgano vegetal.

Palabras clave: Taninos; Excoecaria lucida Sw.; aité; yaití; Excoecaria; taninos derivados del ácido elágico.

ABSTRACT

Introduction: Excoecaria lucida Sw. (Aité) (Euphorbiaceae) is a species the Cuban population uses for medicinal purposes. However, there is insufficient scientific information to support its traditional uses and chemical composition, the reason why it is necessary to carry out chemical and pharmacological studies.
Objectives: To isolate and to structurally identify compounds present in the bark of the species Excoecaria lucida Sw. (Aité) (Euphorbiaceae).
Methods: Isolation and structural identification of the compounds present in the bark were carried out by means of column chromatography with silica-60 gel as a stationary phase, with the subsequent use of spectroscopic techniques, such as infrared spectroscopy and ¹H nuclear magnetic resonance. ¹³C uni- and two-dimensional, quantum multiple heteronuclear correlation, heteronuclear correlation to multiple bonds, correlation spectroscopy, and nuclear overhauser effect spectroscopy.
Results: The tannins were isolated and structurally identified: 3,3'-di-O-methyl-ellagic acid and 3,3'-di-O-methyl-ellagic acid-4-O-D-xylopyranoside.
Conclusions: These tannins derived from ellagic acid, for the species E. lucida Sw. and the genus Excoecaria, were identified and isolated from the bark for the first time, which provides information on the chemical composition of this plant organ.

Keywords: tannins; Excoecaria lucida Sw.; shiny oysterwood; crabwood; Excoecaria; ellagic acid-derived tannins.

INTRODUCCIÓN

Las plantas medicinales son mundialmente utilizadas con fines curativos. Sin embargo, muchas no poseen evidencias científicas experimentales que respalden sus propiedades farmacológicas, toxicidad y composición química. Por tanto, llevar a cabo una investigación de los componentes químicos, conjuntamente con su evaluación farmacológica, posibilita el conocimiento de las potencialidades biológicas de los extractos e indica la naturaleza de las sustancias presentes.¹ Las investigaciones fitoquímicas y farmacológicas constituyen herramientas prioritarias en este sentido.

Los metabolitos secundarios presentes despiertan un gran interés, no solo por las actividades biológicas ejercidas por las plantas (en respuesta a los estímulos del medio ambiente), sino también por la potencial actividad farmacológica que poseen.²

Excoecaria lucida Sw. (Gymnanthes lucida Sw.¨sin¨.) (Yaití, Aité), es una de las especies que crece en Cuba (Macizo Sierra Maestra, Macizo Nipe-Sagua-Baracoa, y Ciénaga de Zapata), aunque también puede encontrarse en Belice, Guatemala, Honduras, México, Estados Unidos y el Caribe.³Tradicionalmente se ha empleado el cocimiento de la corteza para el dolor de muelas y el látex para la destrucción de callos,⁴ mientras que datos etnofarmacológicos de campo informan sobre el uso de las hojas como antiasmático y antimicrobiano.

Existe poca información científica sobre la especie, lo que no permite respaldar científicamente el uso tradicional antimicrobiano de la hoja. Solo se reporta la evaluación antimicrobiana de la corteza⁵y la identificación de los compuestos presentes en el aceite esencial de las hojas a través de cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas (CG/EM).⁶Esta insuficiente información científica y el uso empírico que hace de esta planta la población cubana, motivó el estudio de las potencialidades farmacológicas y químicas de esta especie vegetal.

Entre los resultados que se han obtenido, se encuentra el fraccionamiento bioguiado de la actividad antimicrobiana in vitro de las hojas, lo que resultó en la identificación estructural de varios taninos, como el ácido elágico (784,29 mg, 0,17 %), ácido 3,3',4'-tri-O-metil-elágico-4-O-β-D-glucopiranósido (306,1 mg, 0,06 %), el ácido 3,3',4'-tri-O-metilelágico (71,6 mg, 0,015 %) y la corilagina (6,91 mg, 0,0015 %). Las fases hexánica, de acetato de etilo y el ácido elágico demostraron ser los más activos como antimicrobianos frente a seis, siete y cinco cepas de microorganismos, respectivamente, lo cual confirma el uso tradicional antimicrobiano de las hojas.⁷También se determinó la presencia cualitativa de alcaloides, triterpenos y esteroides, quinonas, flavonoides, cumarinas, lactonas sesquiterpénicas, fenoles y taninos en las hojas; así como la identificación estructural del compuesto mayoritario de la fase butanólica, perteneciente a un hemiterpenoide(2E)-2-metil-2-buten-1,4diol-1-O-β-D-glucopiranósido.³En otro estudio se identificaron por CG/EM, un total de 15 compuestos apolares presentes en la fase hexánica de las hojas, algunos de los cuales podrían estar relacionados con las propiedades antimicrobianas atribuidas a éste órgano.⁸

Para darle continuidad a los estudios fitoquímicos de la especie vegetal, en la presente investigación se proyectó como objetivo el aislamiento e identificación estructural de compuestos presentes en la corteza de Excoecaria lucida Sw. (Aité) (Euphorbiaceae).

MÉTODOS

RECOLECCIÓN Y PROCESAMIENTO DEL MATERIAL VEGETAL

La corteza fue recolectada en la reserva ecológica Siboney-Juticí de la provincia Santiago de Cuba, durante el año 2015, en horas tempranas de la mañana (de 8:00 a 10:00 am). Los ejemplares se encontraban en estado vegetativo. Después de realizada la identificación botánica, una muestra de la especie fue depositada en el Herbario del Centro Oriental de Ecosistemas y Biodiversidad de la ciudad de Santiago de Cuba, registrada como 154 HAC-SC, No. 7384 local: Siboney-Juticí.

PREPARACIÓN DE LOS EXTRACTOS TOTALES

La corteza (3,5 kg) seca y molida se maceró con etanol 95 % por 72 h, en recipiente color ámbar y se agitó manualmente tres veces al día. Luego de repetir este procedimiento por cuatro ocasiones sucesivas, los extractos colectados fueron reunidos y concentrados a sequedad (40 ^oC), en un rotoevaporador IKA-Werke (Alemania), hasta la obtención del extracto total seco de la corteza.

FRACCIONAMIENTO DE LOS EXTRACTOS TOTALES

Una porción de 100 g del extracto total se solubilizó en una disolución de metanol:agua (8:2 v/v). Posteriormente se realizó un fraccionamiento líquido-líquido, en embudo de separación con solventes en orden creciente de polaridad, obteniéndose cuatro fases: hexánica, diclorometano, acetato de etilo y butanólica. Se trabajó con aquellas fases que resultaron positivas al ensayo de Shinoda (para flavonoides) y al de gelatina (para fenoles y taninos).

SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN POR TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

A partir de la composición en taninos de las fases de acetato de etilo y butanólica de las hojas, fueron aplicadas a la corteza estas mismas fases, a cromatografías en columna con gel de sílica-60, como fase estacionaria (0,063-0,2 mm/70-230 Mesh ASTM, Macherey-Nagel, Alemania). Se utilizaron como fase móvil n-hexano, luego mezclas binarias de hexano:diclorometano (90:10-10:90), diclorometano puro, diclorometano:acetato de etilo (AcOEt) (90:10-10:90), AcOEt puro y AcOEt:metanol (90:10-60:40), siempre con una variación de gradiente en proporción de 10 unidades para la fase de AcOEt. Para la fase butanólica se comenzó la elución con AcOEt y luego tres mezclas binarias de AcOEt:metanol (90:10, 70:30 y 60:40). Todos los disolventes utilizados fueron de calidad analítica (Dinámica y Fmaia, ambos de procedencia brasileña).

Las fracciones fueron reunidas según su comportamiento en cromatografía de capa delgada analítica (CCDA). El revelado de las sustancias fue realizado por exposición a lámpara de radiación ultravioleta (UV) en dos longitudes de ondas: 254 y 365 nm, en equipo Biosystems DDG08007031012 (Viber Lourmat, Francia) y también por la impregnación de las placas, en las cámaras cromatográficas con vapores de yodo.

ELUCIDACIÓN ESTRUCTURAL DE LOS COMPUESTOS SEPARADOS

Los compuestos separados fueron evaluados mediante la utilización de las siguientes técnicas espectroscópicas: espectroscopía infrarroja (IR) y de resonancia magnética nuclear (RMN) ¹H y ¹³C uni y bidimensional [correlación heteronuclear múltiple cuántica (HMQC)]; correlación heteronuclear a múltiples enlaces (HMBC); espectroscopía de correlaciones (COSY) y espectroscopía de efecto nuclear overhauser (NOESY), ambas por sus siglas en inglés). Los espectros IR fueron obtenidos en el espectrómetro FTIR, WQF-510A, Main FTOS, Rayleigh, China, en bromuro de potasio (KBr) a la proporción de 0,5 mg de la muestra: 100 mg de KBr. Los espectros de RMN ¹H (unidimensionales) y ¹³C (bidimensionales) fueron obtenidos en espectrómetro VARIAN (EE.UU.) modelo System, a 500 MHz (¹H) y 125 MHz (¹³C) [técnica del protón unido (APT)]. Los análisis de los corrimientos químicos (δ) y acoplamientos spin-spin fueron realizados con el software MestReNova, versión 6,1,0-6 224 del 2010. Los corrimientos químicos (¹H y ¹³C) se expresaron en partes por millón (ppm), relativo al tetrametilsilano (TMS) como referencia interna y las constantes de acoplamiento (J) en Hz. El solvente empleado fue dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-D6, CIL, Cambridge Isotope Laboratories, Inc.). Para los espectros de RMN ¹³C (APT), fue adoptada la condición experimental de que señales hacia la zona de abajo de la línea base del espectro correspondan a carbonos metílicos (CH₃) y metínicos (CH), así como señales para la zona de arriba a carbonos metilénicos (CH₂) y cuaternarios (C).

RESULTADOS

FRACCIONAMIENTO DE LOS EXTRACTOS TOTALES

Las fases de acetato de etilo y butanólica de ambos órganos vegetales resultaron positivas al ensayo de Shinoda para flavonoides y al de gelatina para fenoles y taninos, por ello fueron sometidas al estudio fitoquímico.

SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA Y ELUCIDACIÓN ESTRUCTURAL

De la fase de acetato de etilo se obtuvieron dos sustancias amorfas de color blanco amarillento y solubles en dimetilsulfóxido, las que fueron codificadas como ELC₁ (9,6 mg), -lo que representa 0,00027 % del peso total de la droga seca-y ELC₂ (21,4 mg). De la fase butanólica se aisló también el compuesto ELC₂ (50,3 mg). El rendimiento total de este compuesto fue de 71,7 mg; representa 0,002 % del peso total de la droga seca.

Compuesto ELC₁: ácido 3,3'-di-O-metilelágico (Fig. 1).

Sustancia amorfa, de color blanco amarillenta (9,6 mg).

IR (KBr): 3387, 3268, 2953, 1725, 1611, 1577 cm^-1.

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ_H: 7,5 (2H, s, H-5/H-5'); 4,03 (6H, s, OCH₃-3/OCH₃-3').

¹³C NMR (APT) (125 MHz, DMSO-d₆) δ_C: 111,6 (C/C/C-1/C-1'); 141,1 (C/C/C-2/C-2'); 140,2 (C/C/C-3/C-3'); 152,1 (C/C/C-4/C-4'); 111,4 (CH/CH/C-5/C-5'); 112,0 (C/C/C-6/C-6'); 158,4 (C=O/C=O/C-7/C-7"); 60,9 (OCH₃-3/OCH₃-3').

HMQC ¹H-¹³C ¹J (125 MHz, DMSO-d ₆) δ_H/δ_C: 7,5/111,4; 4,03/60,9.

HMBC¹H-¹³C ⁿJ (n=2,3) (125 MHz, DMSO-d ₆) δ_H/δ_C: 7,5/111,6(³J); 7,5/140,2(³J); 7,5/152,1(² J); 7,5/158,4(³J); 4,03/140,2(³J).

Compuesto ELC₂: ácido 3,3'-di-O-metil elágico-4-O-β-D-xilopiranósido (Fig. 1)

Sustancia amorfa, de color blanco amarillenta claro (71,7 mg).

IR (KBr): 3 392, 1 749, 1 608 cm^-1.

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ_H:aglicona: 7,47 (1H,s,H-5); 7,71 (1H,s,H-5'); 4,03 (3H,s,OCH ₃-3); 4,06 (3H,s,OCH₃-3') xilosa: 5,12 (1H,d,J=7 Hz,H-1''); 3,35 (H-2''); 3,32 (H-3''); 3,40 (H-4''); 3,82 (1H,dd,J=11 y 5 Hz, H-5"a); 3,35 (H-5"b).

¹³C NMR (APT) (125 MHz, DMSO-d₆) δ_C: aglicona: 111,01 (C/C-1); 114,1 (C/C-1'); 141,5 (C/C-2); 140,8 (C/C-2'); 140,1 (C/C-3); 141,9 (C/C-3'); 152,7 (C/C-4); 151,1 (C/C-4'); 111,5 (CH/C-5/); 111,9 (CH/C-5'); 112,6 (C/C-6); 111,7 (C/C-6'); 158,3 (C=O/C-7); 158,2 (C=O/C-7'); 60,9 (OCH₃-3); 61,6 (OCH ₃-3') xilosa: 101,8 (C-1"/CH); 73,02 (C-2"/CH); 76,09 (C-3"/CH); 69,2 (C-4"/CH); 65,7 (C-5"/CH₂).

HMQC ¹H-¹³C ¹J (125 MHz, DMSO-d₆) δ_H/δ_C:aglicona: 7,47/111,5; 4,03/60,9; 7,71/111,9; 4,06/61,6; xilosa:5,12/101,8; 3,35/73,0; 3,32/76,0; 3,40/69,4; 3,82/65,7; 3,35/65,7.

HMBC¹H-¹³C ⁿJ (n=2,3) (125 MHz, DMSO-d ₆) δ_H/δ_C: 7,47/111,01(³J); 7,47/112,6(²J); 7,47/140,1( ³J); 7,47/152,7(²J); 7,47/158,3(³J); 4,03/140,1(³J); 7,71/111,7(²J); 7,71/114,1( ³J); 7,71/141,9(³J); 7,71/151,1(²J); 7,71/158,2(³J); 4,06/141,9(³J); 5,12/151,1( ³J); 5,12/65,7(³J); 3,82/69,4(²J); 3,82/76,0(³J); 3,82/101,8(³J).

DISCUSIÓN

COMPUESTOS ELC₁ Y ELC₂

El espectro infrarrojo obtenido en KBr muestra bandas en 3 387, 3 268 y 3 392 cm^-1, que son características de las vibraciones de valencia en el grupo hidroxilo; mientras que las bandas en 1 611, 1 608 y 1 577 cm^-1, resultan características de las insaturaciones aromáticas. Las señales en 1 725 cm^-1 para ELC ₁ y 1 749 cm^-1 para ELC_2, resultan comunes para vibraciones de valencia en el agrupamiento carbonílico de ésteres cíclicos.

Los espectros de RMN ¹H (500 MHz, DMSO-d₆) para ambas sustancias mostraron similitud, ya que se observan señales características de protones en un sistema aromático [δ_H 7,50 ppm (s,1H) para ELC₁ y δ_H 7,47 (s,1H) y 7,71 (s,1H) ppm para ELC₂]. También la presencia de grupos metoxilos [δ _H 4,03 ppm (s,3H) (ELC₁) y δ_H 4,03 (s,3H) y 4,06 (s,3H) ppm (ELC₂)].

La mayor diferencia observada entre ambos espectros fue que para el compuesto ELC₂aparecen dos señales adicionales: un doblete en δ_H 5,12 ppm (J= 7Hz) (protón anomérico) y un doble doblete en δ_H 3,83 y 3,81 ppm (J= 5 y 11 Hz), con integrales para un protón cada uno, las que corresponden a una unidad de azúcar.

Los espectros de RMN ¹³C-APT (125 MHz, DMSO-d₆) para ambos compuestos, mostraron señales características de cetonas de ésteres cíclicos [δ_C 158,4 ppm (ELC₁); δ_C158,3 y 158,2 ppm (ELC₂ )] y son compatibles con las absorciones obtenidas en el espectro IR para ambos compuestos. También la presencia de grupos metoxilos impedidos estéricamente [δ_C 60,9 ppm (ELC₁) y δ_C 60,9 y 61,6 ppm (ELC₂)]. Otras señales presentes son de carbonos cuaternarios oxigenados, de carbonos metínicos y para el compuesto ELC₂:δ _C101,8 (carbono anomérico) y 65,7 ppm que corresponderían a la unidad del azúcar (xilosa).

Si se considera el número de átomos de carbonos obtenidos y la presencia del grupo carbonilo de ésteres cíclicos, junto a los carbonos oxigenados, el grupo metoxilo y los antecedentes de compuestos aislados en la hoja de esta especie vegetal, se puede sugerir que ambos compuestos pertenecen al grupo de metabolitos secundarios (taninos hidrolizables) derivados del ácido elágico. Un análisis de estos taninos, permitió proponer dos posibles candidatos: uno el derivado dimetoxilado del ácido elágico (ELC₁) y el otro el derivado dimetoxilado del ácido elágico pero unido a una molécula de xilosa (ELC₂). La posición de los grupos metoxilos se pudo discriminar por el empleo del espectro RMN ¹³ C, pues metoxilos que se encuentren en posición orto-orto disustituidos presentan corrimientos químicos de δ_C 63- 59 ppm, a diferencia del resto los cuales muestran desplazamientos de δ_C 58-54 ppm.⁹ En este caso, las señales en δ_C 60,9 y 61,6 ppm para ambos compuestos son evidencias de esta relación orto-orto disustituidos, por lo que se encuentran situados estos dos grupos en las posiciones 3 y 3'.

Para confirmar la estructura propuesta de ELC₁, se obtuvieron los espectros de correlación heteronuclear HMBC y HMQC. Con el espectro HMBC (125 MHz, DMSO-d₆) se confirman las posiciones de los dos protones aromáticos equivalentes al observar correlaciones con los carbonos carbonílicos (C7,7') [δ_H7,5- δ_C158,4(³J)(C7,7')] y los carbonos oxigenados (C3,3',4,4') [δ_H7,5- δ_C140,2(³J)(C3,3') y δ_H7,5 - δ_C152,1(²J)(C4,4')], por lo que estos se sitúan en posición 5 no sustituida. Otra correlación importante [δ_H4,03 - δ_C140,2( ³J) (C3,3')] permitió confirmar la posición 3/3' del grupo metoxilo entre dos funciones oxigenadas.

Con el espectro HMBC (125 MHz, DMSO-d₆) del compuesto ELC ₂, (Fig. 2) se confirman las posiciones de los grupos presentes, al observar correlaciones de los dos protones aromáticos no equivalentes con los carbonos carbonílicos, por lo que estos se sitúan en posición 5 no sustituida. Otras correlaciones importantes son la del protón anomérico (δ _H 5,12 ppm) con δ_C 151,1 ppm y de este último con uno de los protones aromáticos (δ _H 7,71 ppm), lo cual confirma que la unidad de xilosa se encuentra en la posición 4 de uno de los anillos aromáticos simétricos. Adicionalmente, los aspectos estereoquímicos relacionados a la naturaleza del enlace con el azúcar, son resueltos por la constante de acoplamiento de H-1"; al ser expresados a través de J=7 Hz, indica que su estructura estereoquímica es β.

Teniendo en cuenta estos resultados y la comparación con datos bibliográficos,^10,11 se confirma que los compuestos aislados en la fase de acetato de etilo son: el ácido 3,3'-di-O-metil elágico (ELC₁) y el ácido 3,3'-di-O-metil elágico-4-O-β-D-xilopiranósido (ELC₂).

La actividad biológica del ácido elágico y sus derivados ha sido estudiada. Muestran efectos antioxidantes y antimutagénicos. El ácido elágico inhibe fuertemente un número importante de enzimas, como la transcriptasa reversa VIH-1, las polimerasas A y B, al igual que las topoisomerasas humanas I y II. Es conocido además que este compuesto inhibe los efectos mutagénicos de muchos carcinógenos, como la N-nitrosodimetilamina, la aflatoxina B-1 y la N-metil-N-nitrosourea.¹²

La composición polifenólica determinada en la hoja⁷ y la corteza de esta especie vegetal, permite intuir que la planta estudiada podría presentar actividad antioxidante, cuyos resultados para otras especies del género Excoecaria han sido publicados por algunos autores.^13,14

En conclusión, estos taninos derivados del ácido elágico, para la especie E. lucida Sw. y el género Excoecaria, se lograron identificar y aislar de la corteza por vez primera.

Por ello, el presente trabajo constituye un significativo punto de partida para el desarrollo de futuras investigaciones farmacológicas referidas a esa especie vegetal.

CONFLICTO DE INTERESES

Los autores declaran que no presentan conflicto de intereses.

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Recibido: 23 de febrero de 2018.
Aprobado: 22 de abril de 2018.

Ania Ochoa Pacheco. Departamento de Farmacia. Facultad de Ciencias Naturales y Exactas. Universidad de Oriente. Santiago de Cuba, Cuba.
Correo electrónico: aochoap@uo.edu.cu.

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