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Inicio > Vol. 51, No. 1 (2017) > Torrenegra Alarcón

Colombia es un país que posee una gran diversidad de ecosistemas y microclimas, lo cual hace que su vegetación sea muy variada, enriquecida con especies endémicas y con una diversidad genética muy alta, entre las cuales se tienen algunas que poseen aceites esenciales (AE) con principios activos con potencial actividad biológica e industrial, que convierten a Colombia en una región muy interesante para la investigación y desarrollo de nuevos productos naturales.^1-5

Los AE son productos obtenidos del reino vegetal, en los que se concentran sabores y aromas característicos. Están constituidos por mezclas complejas de hidrocarburos, compuestos oxigenados y residuos no volátiles. En general, los AE pueden ser definidos como líquidos aceitosos obtenidos a partir de diferentes partes de las plantas como flores, yemas, semillas, hojas, ramas, cortezas, madera, frutos y raíces.^3,6-8

En particular, el AE de la especie vegetal Matricaria chamomilla perteneciente al género Matricaria conocida comúnmente como manzanilla de Castilla en Colombia, en Chile se le dice Olorosa, en España matricaria y en Centroamérica camomila, es una especie de planta anual, herbácea, erecta, glabra, muy ramificada, que puede alcanzar los 60 cm de altura. Las hojas son sésiles, profundamente divididas en lacinias, muy finas y filiformes. Las inflorescencias o capítulos en los extremos de las ramas, son pequeños, largamente pedunculados, con receptáculo cónico hueco, rodeado de un involucro imbricado y aplastado; las flores periféricas son femeninas, liguladas de color blanco. Las flores centrales son hermafroditas, amarillas, tubulosas. El fruto es un aquenio muy pequeño, verdoso amarillento. Las inflorescencias tienen un olor específico, agradable y un sabor amargo, utilizada en medicina popular para el tratamiento de trastornos digestivos y para inflamaciones e irritaciones de la piel y mucosas.^9-11

Por lo cual, el presente trabajo de investigación tuvo como objetivo caracterizar la composición química y evaluar la actividad antioxidante in vitro del aceite esencial de Matricaria chamomilla L., proveniente del departamento Norte de Santanter, Colombia, a través de dos métodos de extracción la hidrodestilación asistida por microondas (MWHD) y la hidrodestilación convencional (HD).

MÉTODOS

RECOLECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL

Con base en los registros de las colecciones del Herbario Regional Catatumbo, Sarare (HECASE) de la Universidad de Pamplona, las flores de las plantas de manzanilla (Matricaria chamomilla L.) fueron recolectados en una vereda del municipio de Pamplona, Norte de Santander (7°22′34″N 72°38′54″O).

PROCESAMIENTO DEL MATERIAL VEGETAL

Las hojas colectadas fueron lavadas con agua y seleccionadas para garantizar buen estado; seguidamente se trocearon, pesaron y procesaron inmediatamente. La obtención del AE por HD, se realizó en un equipo de hidrodestilación del tipo Clevenger. El material vegetal (500 g), se introdujo en el balón de extracción, el cual contenía 500 mL de agua destilada. El tiempo de extracción fue de tres horas.^5,7

La obtención del AE por MWHD, se llevó a cabo en un equipo de destilación tipo Clevenger con un reservorio de destilación Dean Stark adaptado a un sistema de calentamiento por radiación de microondas, un horno microondas convencional marca (Samsumg, Estados Unidos), con una potencia del 70 %, dentro del cual se colocó un balón de extracción de 4 L con 500 mL de agua destilada y 500 g del material vegetal. El tiempo de extracción fue de 1 hora.^5,7

En ambos casos los aceites esenciales obtenidos se separaron por decantación e inmediatamente fueron almacenaron en viales ámbar a 4 ºC hasta la realización de los respectivos análisis. Los rendimientos en la extracción se evaluaron por triplicado, operando siempre bajo las mismas condiciones, según la ecuación 1 siguiente:

Donde, W_AE es el peso (g) obtenido del aceite esencial y W_MV corresponde al peso en gramos (g) del material vegetal fresco.

DETERMINACIÓN DE PROPIEDADES FÍSICAS DEL AE

A cada muestra de AE se le midieron las siguientes propiedades físicas: a) densidad relativa a 20 °C; b) índice de refracción; c) solubilidad del AE en etanol (70 % v/v): en un tubo de plástico con tapa de 1,5 mL se adicionaron 100 μL de etanol al 70 % (v/v) y 2 μL del AE.^5,8 La mezcla se homogenizó en un vórtex a 200 r·min^-1 hasta obtener una solución homogénea; d) rotación óptica: se preparó una disolución al 10 % (p/v) del AE en etanol (96 %).⁷ El análisis fue realizado utilizando un polarímetro (Sper Scientific, Estados Unidos) provisto de una celda de 10 mL, a una temperatura de 20 ºC y la línea D del sodio (589 nm).^12-14

ANÁLISIS DEL AE POR CROMATOGRAFÍA DE GASES/ESPECTRÓMETRO DE MASA (CG/EM)

Se empleó un equipo CG/EM 7890A/5975C Agilent (Estados Unidos) en interfase con un detector selectivo de masas HP5973 Network conectado en línea con un sistema HP-MS ChemStation y la base de datos NIST-2008. Las condiciones de operación fueron una columna capilar HP-5MS (5 % phenyl methyl silox, 30 m x 250 μm x 0,25 μm), temperatura inicial 45 °C, temperatura de la línea de transferencia de 280 °C y volumen de inyección 1,0 μL en modo split (20:1), con temperatura del inyector de 250 °C. ^5,7,8,15,16 La detección de los compuestos se realizó por comparación del espectro de masas, en cada tiempo de retención, con los reportados en la base de datos NIST-2008.

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE LOS ACEITES ESENCIALES

Ensayo de reducción MTT: de acuerdo a la literatura fue utilizado un test in vitro para la evaluación de los aceites esenciales en células HepG2. La metodología empleada estuvo basada en ensayos in vitro con células HepG2, evaluando la toxicidad de los aceites esenciales.¹⁷

Para estudiar la citotoxicidad de los aceites esenciales se empleó el ensayo MTT, mediante este método colorimétrico se evaluó la susceptibilidad de la línea, HepG2 (células hepáticas), de acuerdo a la metodología descrita por Zarai et al.¹⁸ Un total de 10 000 células/ pozos fueron incubadas en medio RPMI 1640 suplementado con 10 % SFB (Suero Fetal Bobino) a 37 °C con 5 % de CO₂ durante 72 horas, previa exposición a las diferentes concentraciones de los aceites esenciales (0,01; 0,1; 1,0; 10 y 100 µg/mL) disueltos en dimetilsulfóxido, como control positivo: anfotericina B, control de viabilidad células con solamente medio RPMI 1640 (Medio Roswell Park Memorial Institute RPMI 1640) y células sin medio. La producción de Formazán fue medido a un OD de 570 nm, se determinó el porcentaje de mortalidad.^17,18

Método del radical DPPH •: la actividad captadora de radicales libres DPPH• se determinó empleando el método descrito por Silva et al. ¹⁹ (con algunas modificaciones 75 µL de muestra fueron adicionados a 150 µL de una solución metanólica de DPPH• (100 µg/mL) y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min, luego de los cuales se determinó espectrofotométricamente la desaparición del radical DPPH• a 550 nm en lector de microplacas Multiskan Ex (Thermoscientific).^20-23 Se utilizó ácido ascórbico (25 µg/mL como control positivo de captación de los radicales DPPH•).

Donde A₀ y A_f son los valores de absorbancia del blanco (solución de DPPH en alcohol) y la muestra (solución de DPPH más antioxidante disueltos en alcohol), respectivamente.

Método del radical ABTS •⁺: la actividad captadora del radical libre ABTS• se determinó empleando el método descrito por Re et al.²⁴ con algunas modificaciones. El radical ABTS• se formó tras la reacción de 3,5 mM de ABTS con 1,25 mM de persulfato potásico (concentración final). Las muestras fueron incubadas entre 2-8 °C en la oscuridad durante 16-24 h. Una vez formado el radical ABTS se diluyó con etanol hasta obtener una absorbancia de 0,7±0,05 a 734 nm. A un volumen de 190 µL de la dilución del radical ABTS se le adicionaron 10 µL de la muestra de AE y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos; luego de transcurrido este tiempo, se determinó espectrofotométricamente la desaparición del radical ABTS a 734 nm en el lector de microplacas Multiskan Ex (Thermoscientific). Se utilizó ácido ascórbico (4 µg/mL) como control positivo de captación de los radicales ABTS•.

MÉTODO ORAC

a) ORAC hidrofílico: en esta evaluación se empleó trolox como estándar y condiciones controladas de temperatura (37 °C) y pH (7,4). Las lecturas se realizaron a una l de excitación de 493 nm y de emisión de 515 nm. Para el desarrollo de la técnica se utilizaron soluciones de fluoresceína 1x10 ^-2 M en PBS (75 mM) y AAPH 0,6 M en PBS (75 mM). La muestra se preparó mezclando 21 μL de fluoresceína, 2,899 μL de PBS, 30 μL del extracto (muestra problema) y 50 μL de AAPH. El efecto protector del antioxidante se calculó usando las diferencias de áreas bajo la curva de decaimiento de la fluoresceína con el blanco y la muestra, y el resultado se comparó con la curva obtenida para el trolox. Los resultados se expresaron en micromoles de equivalentes de trolox por cada 100 gramos de muestra (μmol Tx/100 g muestra), de acuerdo a la siguiente ecuación (3).²³

Donde AUC es el área bajo la curva de la muestra, AUC° es el área bajo la curva para el control, AUC_trolox área bajo la curva para el trolox, f es el factor de dilución de los extractos.

b) ORAC lipofílico: se siguió el procedimiento previamente descrito a excepción de que la muestra y el trolox fueron preparados con ciclodextrina metilada (7 %) y en una mezcla de acetona:agua al 50 %. Las disoluciones se agitaron durante una hora y se procedió al análisis de acuerdo con lo descrito en el método ORAC hidrofilico.²³

Todos los ensayos se realizaron por triplicado siguiendo los protocolos establecidos anteriormente, los resultados se expresaron como el promedio ± el error estándar de la media (ESM) y se analizaron mediante Prueba t de Student. Valores de P<0,05 fueron considerados significativos. Para los análisis estadísticos se utilizó el paquete GraphPadPrism V 5.00 para Windows.

 

RESULTADOS

Los AE de las flores de la manzanilla presentan una coloración translucida. Las propiedades fisicoquímicas de estos aceites son descritas en la tabla 1.

La identificación de los componentes, los tiempos de retención y porcentajes de abundancia por CG/EM son reportados en la tabla 2. Los sesquiterpenos son los metabolitos volátiles con mayor abundancia en los AE. El compuesto mayoritario encontrado fue el bisabolol con un porcentaje de abundancia relativa de (85,0 %) y (90,05 %) para los métodos de HD y MWHD respectivamente.

Los ensayos de citotoxicidad celular son ampliamente utilizados en estudios de toxicología in vitro. El ensayo MTT es uno de los métodos más empleados para el estudio de citotoxicidad o viabilidad celular seguido de la exposición a sustancias tóxicas.^17,18 Los resultados demuestran que a diferentes concentraciones de AE la viabilidad celular se mantiene en un 100 % en todos los casos (figuras 1a y 1b).

La actividad antioxidante del AE de E. globulus, se evaluó por tres métodos diferentes: DPPH•, ABTS•⁺ y ORAC. Los resultados se expresan como actividad antiradical o IC₅₀, la cual está definida como la concentración del antioxidante que disminuye la absorción del radical a un 50 % de la cantidad inicial. ²⁵ En la tabla 3 se presentan los resultados obtenidos en la determinación de la capacidad antioxidante de las muestras provenientes de los AE extraídos por los métodos HD y MWHD analizadas por los métodos DPPH^•, ABTS ^•+ y ORAC. Los resultados de la actividad captadora de radicales DPPH^• y ABTS^{• +} del AE de M. chamomilla obtenidos por dos métodos de extracción (HD y MWHD) variaron entre 122,90±0,2 y 108,07±0,2 µg/mL para el DPPH•, y de 59,07±0,33 a 50,50±0,05 µg/mL para el ABTS ^•+. De los dos métodos que se estudiaron, se obtuvieron mejores resultados por HD. Es posible inferir que cada técnica de extracción por sus condiciones de reacción y solubilidad propicie la existencia de diversos compuestos con potencial antioxidante en la mezcla.²³ Los valores de actividad antioxidante obtenidos con el ABTS^•+ y expresados como µg/mL, son menores que los obtenidos con la técnica del DPPH^•. Sin embargo, de acuerdo con los resultados obtenidos por ORAC, la mayor actividad antioxidante se obtuvo para el AE obtenido por MWHD. El valor ORAC lipofílico e hidrofílico fue de 456,678±0,00 y 396,68±0,03 mM trolox/100 g de muestra, respectivamente. El resultado anterior demuestra que este AE tiene una alta capacidad de inhibir la decoloración de la molécula de fluoresceína.

 

DISCUSIÓN

Torrenegra et al.⁵ indicaron que a mayor índice de refracción el AE contendrá mayores terpenos bencénicos. Según este criterio el aceite esencial posee ligeramente más compuestos terpénicos.

La literatura científica menciona que valores mayores a 1,00 indican la presencia de terpenos aromáticos, nitrogenados y azufrados; en cambio, valores menores, incluso cercanos a 0,840, atestiguan la presencia de hidrocarburos aromáticos.⁵

La prueba de solubilidad en etanol al 70 % fue positiva para los diferentes AE obtenidos ambos métodos. El comportamiento de solubilidad es semejante al reportado por Torrenegra et al.;⁵ lo anterior, se debe principalmente al contenido de compuestos oxigenados en los AE. La presencia de compuestos oxigenados aumenta la afinidad por el solvente y, adicionalmente, los aldehídos y alcoholes poseen la capacidad de formar puentes de hidrógeno; por tal razón, el contenido de compuestos oxigenados, además de proveer las notas aromáticas agradables a los AE, aumentan su solubilidad en etanol haciéndolos más aptos para su aplicación en la industria.

Los resultados de los análisis de CG/EM indican que en ambas metodologías se obtienen componentes que aparecen a un mismo tiempo de retención y con un porcentaje de abundancia relativa similar.

Raal et al.²⁶ encontraron como componente mayoritario del aceite esencial de Matricaria recutita L al bisabolol,²⁷ resultado que este compuesto presenta en el perfil cromatográfico mostrado y es el componente mayoritario igualmente. Sin embargo, es visible una pequeña variación con respecto a los componentes minoritarios encontrados por Raal et al.²⁶ ocasionado por el efecto de diferentes factores ambientales sobre el contenido de compuestos en plantas medicinales. La intensidad de la luz y el fotoperíodo, que varían de región en región; época de recolección y edad de las plantas afectan la composición del aceite esencial.

Este compuesto principal denominado bisabolol es un componente habitual de muchos productos destinados al cuidado de la piel, puesto que presenta propiedades antiinflamatorias y antiradicalarios.^28,29

Los resultados del ensayo MTT evidenciaron que no hubo diferencias estadísticamente significativas entre los valores de viabilidad para las diferentes concentraciones de los diferentes AE por las dos metodologías de extracción evaluadas en el ensayo, al ser comparadas con el control negativo, convirtiéndolo claramente en un componente terapéutico de amplio alcance.¹⁷ Al igual que al evaluar los controles, el control positivo presentó una disminución significativa de la viabilidad celular. Esto está de acuerdo con los datos presentados en la literatura.¹⁸ Aunque existen otros criterios de toxicidad de igual importancia.

Los resultados muestran que para todos los AE los valores de ABTS, y expresados como μg/mL, son menores que los obtenidos con la técnica del DPPH; el método de la decoloración del catión-radical ABTS+• es aplicable a antioxidantes lipofílicos e hidrofílicos lo que le permite ser implementado para sistemas tanto acuosos como lipofílicos; además, el ABTS es muy soluble en agua y químicamente estable; en cambio, el DPPH solo puede disolverse en medio orgánico por lo que mide preferentemente la capacidad antioxidante de compuestos poco polares o no polares. De los AE estudiados el más activo, debido a que mostró una actividad superior, fue el AE de M. chamomilla obtenido por MWHD.^30,31

Los antioxidantes pueden actuar por múltiples mecanismos, dependiendo del sistema de reacción o de la fuente radicalaria u oxidante utilizada.³² Muñoz-Velázquez et al.¹⁰ evaluaron la capacidad antioxidante de infusiones comerciales de Matricaria chamomilla L, obteniendo unos valores en el intervalo de ABTS de 0,52±0,02 a 0,60±0,010 μmol eq.Tx/mL. En este trabajo se obtuvo un valor de 59,07±0,33 μg/mL, esta diferencia podría ser por la diferente composición que existe entre una infusión y un aceite esencial. De hecho, otros estudios confirman la actividad antioxidante del AE de manzanilla.^33-35 Cabe resaltar que el aceite esencial de Matricaria chamomilla L. es considerado como promisorio para diseñar productos magistrales con actividad antioxidante.

La Matricaria chamomilla L puede ser una fuente para el desarrollo de antioxidantes naturales con potencial aplicación en la industria alimentaria, cosmética y farmacéutica, asimismo se puede afirmar que la capacidad antioxidante presentada por el aceite esencial de Matricaria chamomilla L está relacionada con la presencia del bisabolol.

 

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a la Universidad de Cartagena, a la Universidad de Pamplona y al SENA por facilitar espacio, recursos y tiempo de los investigadores.

CONFLICTO DE INTERESES

Los autores declaran no existir conflicto de intereses.

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Recibido: 29 de septiembre de 2016.
Aprobado: 30 de noviembre de 2016.

 

 

Miladys Esther Torrenegra Alarcón. Grupo de Investigación de Biotecnología e Innovación (GIBEI). Centro de Comercio y Servicios, Regional Bolívar. Ternera Km 1, Vía Túrbaco, Cartagena, Colombia. Teléfono: (575)6537251. Celular: (57)3113565598.
Correo electrónico: mtorrenegraa@sena.edu.co, mtorrenegraa@hotmail.com

 

 

 

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