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Artículo original
Perfil químico y actividad antifúngica del aceite esencial de la flor de Bauhinia rufa (Bong.) Steud
Chemical Profile and Antifungal Activity of the Essential Oil of the Bauhinia rufa (Bong.) Steud Flower
Antonio
Carlos Pereira de Menezes Filho1
Dâmaris
Hadassa Rangel Fonseca Bessa1
Carlos Frederico
de Souza Castro1
1Instituto
Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Goiano, Campus Rio
Verde, Rio Verde, Goiás, Brasil.
RESUMEN
Introducción:
El género Bauhinia está compuesto por más de 300
vegetales en el mundo, donde varias especies muestran actividad antifúngica
comprobada.
Objetivo:
Evaluar el perfil químico del aceite esencial de la flor Bauhinia rufa
(Bong.) Steud de cuatro regiones de Goiás, Brasil para determinar su actividad
antifúngica frente a aislados de Candida.
Métodos:
La extracción del aceite esencial de la flor de Bauhinia rufa
se realizó en sistema tipo Clevenger. El rendimiento se determinó
por la diferencia en masa y la densidad relativa en picnómetro. El perfil
químico se evaluó mediante cromatografía de gases/espectrómetro
de masa y la actividad antifúngica se determinó a diferentes concentraciones
de aceite esencial por el método de difusión en disco. La prueba de
Tukey se realizó para diferencia estadísticamente significativa (p
< 0,05).
Resultados:
El rendimiento del aceite esencial fue del 0,067 %; 0,045 %; 0,098 % y
0,065 %, con densidades respectivas de 0,907 g mL-1; 0,905 g mL -1;
0,908 g mL-1 y 0,904 g mL-1 para las regiones de Rio Verde,
Jataí, Caiapônia y Pilar de Goiás. El perfil químico mostró
la presencia de 39 compuestos, seis con el porcentage más altos β-pineno,
Trans-verbenol, elemol, globulol, viridiflorol y oplopanona. La actividad
antifúngica contra el género Candida fue satisfactoria frente
a todos los aislados testados.
Conclusiones:
El AE de la flor Bauhinia rufa (Bong.) Steud manifiesta un buen
contenido de aceite esencial y los resultados de su actividad antifúngica
para las cepas de Candida evaluadas lo sitúan como un posible candidato
para desarrollar un nuevo antifúngico.
Palabras clave: género Bauhinia; perfil químico por CG-EM; género Candida.
ABSTRACT
Introduction:
The genus Bauhinia is made up of more than 300 plants worldwide. Several
of its species have shown antifungal activity.
Objective:
To evaluate the chemical profile of the essential oil of the Bauhinia rufa
(Bong.) Steud flower from four regions of Goiás, Brazil, to determine
its antifungal activity against Candida isolates.
Methods:
Essential-oil extraction from the Bauhinia rufa flower was carried out
using a Clevenger-type system. The yield was determined by the mass difference
and relative density in pycnometer. The chemical profile was evaluated by gas
chromatography/mass spectrometer, and the antifungal activity was determined
at different essential oil concentrations using the disk diffusion method. The
Tukey test was performed for statistically significant difference (p<0.05).
Results:
The essential oil yield was 0.067%; 0.045%; 0.098%, and 0.065%, with densities
of 0.907 g mL-1; 0.905 g mL-1; 0.908 g mL -1
and 0.904 g mL-1, respectively for the regions of Rio Verde, Jataí,
Caiapônia, and Pilar de Goiás. The chemical profile showed the presence
of 39 compounds: six with the highest percentage of β-pinene, trans-verbenol,
elemol, globulol, viridiflorol and oplopanone. Antifungal activity against the
genus Candida was satisfactory against all the isolates tested.
Conclusions:
The essential oil of the Bauhinia rufa (Bong.) Steud flower shows good
content of essential oil. The evaluation outcomes of its antifungal activity
evaluation against the Candida strains analyzed place it as a possible
candidate to develop a new antifungal.
Keywords: genus Bauhinia; chemical profile by GC-MS; genus Candida.
Recibido:
13/02/2020
Aceptado:
27/05/2020
INTRODUCCIÓN
El dominio Cerrado es el segundo más grande en el área territorial, así como en la composición de la fauna y flora de Brasil y del mundo, estando solo detrás del bioma Amazónico. Acoge alrededor de 12 000 especies de plantas identificadas y bien distribuidas en las diversas fitofisiognomías de este gran dominio biológico, que también se considera una transición entre otros biomas brasileños. Además, se plantea que el Cerrado es uno de los 25 hotspot biológicos del mundo.(1)
En Brasil el clima tropical es un factor de gran importancia en su rica variabilidad genética vegetal, entre las que se encuentra el género Bauhinia que está incluido en la subfamilia Caesalpinioideae y en la tribu Cercideae. Este género tiene alrededor de 300 especies distribuidas en todo el mundo, siendo uno de los grupos más grandes en representatividad de plantas.(2) En el país se identifican alrededor de 61 especies de Bauhinia en todo el territorio nacional, y es en El Cerrado donde se encuentra la mayor cantidad, con 36 especies. La especie Bauhinia rufa (Bong.) Steud se encuentra en este dominio brasileño, en fitofisiognomías en sentido restringido, Cerrado delgado, Cerrado sucio, transición, cerradão y al borde de carreteras antropomorfizadas.(3,4)
El género Bauhinia se conoce popularmente como unha-de-pata o pata-de-pata. La mayoría de sus especies son utilizadas en la fitoterapia popular para curar y tratar enfermedades del tracto urinario, con acción amebicida, antidisentérica, antiinflamatoria, analgésica, antirreumática, hipocolesterolémica y antidiabética.(5,6) Las flores de B. rufa tienen un aroma delicado debido a la presencia de aceite esencial (AE). Se han realizado estudios de algunas de las especies de este género que confirman su actividad antimicrobiana y citotóxica, como garrapaticida e insecticida contra las larvas del mosquitoAedes aegypti usando AE de las hojas de Bauhinia sp.(7,8,9)
Los AE se pueden extraer de cualquier órgano vegetal, como raíces, tubérculos, ramas, tallos, hojas, flores, frutas y semillas por hidrodestilación o por prensado mecánico, este último está bien diversificado para especies de cítricos.(10) Los aceites esenciales están compuestos principalmente por monoterpenos, diterpenos, triterpenos, sesquiterpenos y por fenilpropanoides del metabolismo natural secundario de las plantas. El uso de AE está bien diversificado como aromas, fragancias, fijadores de fragancias, composiciones farmacéuticas y tópicas, así como comercializado en su forma cruda o procesado.(11,12)
Además de estas características, el AE puede usarse como agente antifúngico, mostrando resultados importantes de inhibición del crecimiento en hongos patógenos y fitopatógenos.(13,14,15)
El género de hongo Candida anualmente causa serios problemas de infecciones en la cavidad oral y genital. Su principal factor de virulencia es la capacidad de adherirse a los tejidos orales y genitales formando biopelículas.(16) Las infecciones fúngicas más comunes están causadas por C. albicans, C. guilliermondi , C. krusei y C. tropicalis, que se conocen popularmente como candidiasis, estomatitis eritematosa o estomatitis protésica. Los pacientes inmunodepresivos con el virus del VIH constituyen el grupo con mayor riesgo de contaminación por infecciones fúngicas, las que se consideran como enfermedades oportunistas para este grupo de riesgo.(17)
Numerosos estudios muestran importantes acciones biológicas, especialmente en la actividad antifúngica de extractos y aceites esenciales extraídos de vegetales. La naturaleza es rica en compuestos del metabolismo primario y secundario de las plantas, las que son fuentes alternativas a las drogas sintéticas. De ahí la importancia que tiene continuar con el estudio del género Bauhinia y la evaluación de sus aceites esenciales como posibles antifúngicos.
Estos estudios tienen gran significancia porque algunos fármacos antimicóticos de referencia han demostrado una baja actividad fungistática debido a la resistencia presentada en numerosas cepas, principalmente en el género Candida.(18,19) Por lo que el uso de metabolitos de plantas secundarias, como AE se convierte en una forma viable para el tratamiento individual o combinado con otros fungicidas.
De ahí que el presente trabajo tenga como objetivo evaluar el perfil químico del aceite esencial de la flor Bauhinia rufa (Bong.) Steud de cuatro regiones de Goiás, Brasil para determinar su actividad antifúngica frente a aislados de Candida.
MÉTODOS
Recolección del material vegetal y la identificación
Durante el periodo abril-mayo de 2019 se recolectaron flores de B. rufa, de cuatro regiones del estado de Goiás, con las siguientes referencias geográficas (GPS, garmin, Mod. eTrex 10): Rio Verde 17°47'13.7''S 50°58'00.1W (RV), Jataí 17°53'35.0''S 51°40'42.3''W (JI), Caiapônia 16°57'52.4''S 51°51'18.5''W (CA) y Pilar de Goiás 14°45'50.0''S 49°29'53.4W (PG). Las flores se cosecharon durante las primeras horas de la mañana (6:00 am a 8:00 am); 3,5 kg de flores por cada área y se transportaron en condiciones de refrigeración hasta el laboratório de Química Tecnológica. Una excicata se depositó en el Herbário de lo Instituto Federal Goiano, campus de Rio Verde con el Voucher HRV 0001.
Extracción del aceite esencial
Para la extracción del AE las flores se pesaron por cuadruplicado, donde para cada alícuota se pesaron aproximadamente 150 g de muestra, para cada región recolectada. Las flores se procesaron en un procesador doméstico con 500 mL de agua destilada. El proceso de extracción se llevó a cabo en un aparato Clevenger durante 3 horas a reflujo. El hidrolato se separó con 3 lavados usando 30 mL de diclorometano (alphatec, con pureza de 99,5 %). Poco después, las fracciones se combinaron y se secaron con sulfato de sodio anhidro (anidrol, con pureza de 99,0 %). Luego, la solución se filtró en papel de filtro cuantitativo faja azul. El sobrenadante se depositó en un vaso de precipitados envuelto en papel de aluminio con pequeños agujeros para la evaporación del disolvente. El sistema se mantuvo en un lugar oscuro con una temperatura de 25 °C hasta la evaporación completa del disolvente. El aceite se recogió y se midió, determinando el rendimiento en (%) de AE (m/v) según la ecuación 1.
% Rend = (AEe/Mf)*100 (1)
Donde: AEe, aceite esencial extraído; Mf, masa de flor.
Determinación de la densidad relativa del aceite esencial a 20 °C
Se usó un picnómetro limpio y seco de 1 mL de capacidad. El picnómetro se pesó primero vacío, en una balanza analítica. Luego se agregó el AE de B. rufa, se tapó y se limpió para eliminar el exceso de muestra. Después de la limpieza se pesó el conjunto y se determinó la densidad relativa del AE.(20) La que se estableció de acuerdo a la ecuación 2.
DR = [(Ppicnómetro + muestra) - (Ppicnómetro)] (g)/VAE (mL) (2)
Donde: Ppicnómetro peso del picnómetro; VAE volumen del aceite esencial.
Determinación del perfil químico por cromatografía de gases/espectrómetro de masas
El análisis de los componentes químicos del aceite esencial de la flor de B. rufa se realizó en un sistema de cromatografía de gases acoplado a un espectrómetro de masas (CG-EM), equipado con autoinyector (Combi PAL AOC-5000 Shimadzu), columna Restek Rtx-5ms (30 m x 0,250 mm x 0,25 μm) y espectrómetro de masas secuencial (MSTQ8030 Shimadzu) con detector electrónico de ionización de impacto (IE) (70 eV). La temperatura inicial se mantuvo a 60 ºC durante 3 min, seguida de un aumento de 3 ºC min-1 hasta alcanzar 200 ºC y posteriormente se programó para un aumento de temperatura de 15 °C min-1 a 280 °C, permaneciendo a esa temperatura durante otros 1 min.
Las temperaturas del inyector y del detector fueron de 230 °C y de 300 °C. Los análisis se realizaron utilizando gas He como vehículo, con una presión de inyección de 57,4 KPa, relación Splitless: 150, rango de detección del espectrómetro de masas: 43-550 m/z, tiempo de inicio (tiempo de corte del solvente): 3 min y flujo de 3 mL min-1. La identificación de los componentes del aceite se basó en el índice de retención lineal (índice de Kovats) (IK) calculado en relación con los tiempos de retención de la serie homóloga de n-alcanos (C-07 a C-40) (sigma aldrich - supelco) y en el patrón de fragmentación observado en los espectros de masas, comparándolos con la literatura(21) y la espectroteca (Nist 11).
Evaluación de la actividad antifúngica contra el género Candida por difusión en disco
En un tubo de ensayo estéril se añadieron 0,4 mL de AE de la flor de B. rufa, 0,04 mL de Tween 80 (synth, con pureza de 98,0 %) y 5 mL de agua ultrapura estéril. El procedimiento se realizó en una cámara de flujo laminar. El tubo de ensayo se cerró y se homogeneizó en un agitador tipo Vortex (fanem, Mod. 251) durante 3 minutos. Se obtuvo una solución final con 8 % de AE.(22) Los AE se evaluaron frente a aislados de cepas del género Candida: C. albicans ATCC 2115-1, C. guilliermondi ATCC 2018-2, C. krusei ATCC 2047-3 y C. tropicalis ATCC 2591-4 adquiridos comercialmente en forma liofilizada. Las cepas se encuentran en un banco micológico del Laboratório de Química Tecnológica del Instituto Federal Goiano, campus Rio Verde, Goiás, Brasil.
Las cepas se resuspendieron en 20 mL de medio estéril Caldo Sabouraud Dextrosa (kasvi - CSD) estéril. La suspensión se incubó en agitación en una mesa de incubación durante 24 h. a 36 °C. Partiendo de este cultivo se prepararon inóculos que contenían aproximadamente 106 UFC mL-1 se estandarizaron de acuerdo con la turbidez en un tubo de 0,5 en la escala de McFarland, en espectrofotómetro UV-Vis (bel photonics - Mod. UV-M51). La prueba antifúngica se realizó en un medio sólido Agar Sabouraud Dextrosa (kasvi - ASD) usando discos de papel de filtro estéril con un diámetro de 7 mm. Placas de Petri con un diámetro de 9 cm con medio ASD estéril, después de la solidificación, fue agregado 1 mL de la suspensión fúngica, y homogeneizado con alza de Drigalski. Y luego se depositaron 4 discos de papel de filtro que contenían 50 µL mL-1 de la solución ajustada a la concentración (2, 4, y 8 %) de AE de la flor de B. rufa, diluido en dimetilsulfóxido (DMSO - sigma aldrich, con pureza del 99,7 %). El DMSO se probó previamente como control negativo.
Las placas se incubaron de 24-46 h a 35 °C. Después al final del período de incubación, se consideró el diámetro de los halos de inhibición en las concentraciones de AE y del antifúngico comercial Ketoconazol® obtenido con un calibrador digital con un error de medición igual a (0,01 mm). La inhibición mínima evaluada fue de un halo con mínimo de 10 mm de diámetro. Se realizaron dos controles, uno negativo con Tween 80, y un control positivo de sensibilidad de las cepas evaluadas a través de la acción del antimicótico estándar Ketoconazol® (sustancia aislada, con pureza del 98 % purifarma) en una solución acuosa con la concentración (50 µg mL-1).(14)
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Todos los ensayos se realizaron por cuadruplicado, los resultados se expresaron como el promedio ± el error estándar. La prueba de Tukey se realizó para diferencia estadísticamente significativa ( p < 0,05).
RESULTADOS
El AE de la flor de B. rufa mostró un rendimiento de 0,067 ± 0,06b; 0,045 ± 0,07c; 0,098 ± 0,03a y 0,065 ± 0,09b para Rio Verde, Jataí, Caiapônia y Pilar de Goiás respectivamente, con una diferencia significativa solo para las muestras de Caiapônia y Jataí, como lo muestra la prueba de Tukey (p < 0,05). La densidad relativa fue 0,907 ± 0,0003a; 0,905 ± 0,0001b; 0,908 ± 0,0003a y 0,904 ± 0,0004b g mL -1 para Rio Verde, Jataí, Caiapônia y Pilar de Goiás, con diferencia significativa formando dos grupos para las muestras de (RV y CA) y (JI y PG) según la prueba de Tukey (p < 0,05). La tabla 1 muestra los perfiles químicos de los AE de las flores de B. rufa recolectada en diferentes municipios del estado de Goiás, Brasil (Tabla 1).
Los compuestos mayoritarios fueron β-pineno 12,36; 19,74; 15,00; 11,23 % (RV, JI, CA y PG), Trans-verbenol 11 % (JI), elemol 10,18 % (CA), globulol 9,00 % (JI), viridiflorol 11,55; 8,32; 15,08; 10,12 % (RV, JI, CA y PG), oplopanona 10,66; 8,08 % (RV y PG), respectivamente.
La tabla 2 muestra el diámetro de inhibición para 4 cepas de Candida en diferentes concentraciones (2 %, 4 %, 6 % y 8 %) de AE de la flor de B. rufa recolectada en diferentes regiones del estado de Goiás, Brasil. Los resultados de inhibición se expresan en milímetros (mm) en un halo de antibiosis causado por las cepas evaluadas. Los halos de antibiosis se forman a partir de la sensibilidad para cada cepa por uno o en sinergia en los compuestos para cada fracción de AE evaluado.
DISCUSIÓN
La presente investigación es el primer estudio, que se tenga conocimiento, que evalúa la regionalidad en la constitución química del AE de la especie B. rufa, de la que se determinaron 39 compuestos. Poco se sabe sobre la constitución química del AE de este género, ya que tiene numerosas especies distribuidas en los trópicos. El rendimiento mostró una diferencia estadística que forma tres grupos (a, b y c) para el AE recolectado en los municipios de Caiapônia grupo (a) y Jataí grupo (c) por la prueba de Tukey ( p < 0,05). No hubo diferencia estadística para el AE recolectado en los municipios de Rio Verde y Pilar de Goiás grupo (b) por la prueba de Tukey (p < 0,05).
Solo se encontraron en la literatura consultada dos estudios que evalúan el AE de las flores de Bauhinia.(1,23) Uno de ellos es el de Sahoo y otros,(24) en el que los investigadores obtuvieron un rendimiento del 0,25 % para el AE de la flor de Bauhinia variegata. Los registros de rendimiento de AE en flores del género Bauhinia son escasos. Por su parte en un estudio en el que solo se quería comparar el rendimiento extraído de las flores, Pires y otros(25) obtuvieron un rendimiento del 0,3 % para el AE de la flor de C. viminalis.
Las densidades alcanzadas en el presente estudio, entre las cuatro muestras de AE, son compatibles y similares a las obtenidas por Alarcón y otros,(20) quienes evaluaron el AE de las hojas de E. globulus en dos procesos de extracción, uno simple y otro asistido y encontraron densidad igual a 0,901 g mL-1 y 0,905 g mL-1 para hidrodestilación simple y por microondas, respectivamente.
El análisis realizado por CG-EM reveló la presencia de 6 compuestos mayoritarios que varían en la concentración entre las regiones de recolección de las flores de B. rufa. Algunos compuestos no fueron constantes en las 4 muestras de AE evaluadas, lo que sugiere que los compuestos del metabolismo secundario de esta especie de planta varían según las regiones de recolección, factores intrínsecos y extrínsecos como altitud, suelo, incendios, lluvia, tipo de fisonomía, variabilidad genética e irradiación solar, los que influyen en el contenido y la cantidad de compuestos.(25,26) Sahoo y otros(23) identificaron compuestos con un mayor porcentaje de γ-Elemeno (19,0 %) y Cis -murrol-5-en-4-α-ol (24,4 %) para el AE de la flor de B. variegata.
Con respecto a la prueba antimicótica, se observaron buenos resultados de inhibición a través de la prueba de difusión de disco. Todas las concentraciones (2 %, 4 %, 6 % y 8 %) tuvieron un efecto inhibidor satisfactorio; especialmente para concentraciones de 6 % y 8 % con las tasas de inhibición más altas observadas por la formación del halo de antibiosis. El AE recolectado en Caiapônia mostró un mayor halo de inhibición para C. guilliermondi, lo mismo se observó para el AE en la región de Río Verde para C. krusei y similar para el AE recolectado en Jataí en comparación con el ketoconazol antifúngico de referencia. Sin embargo, el AE recolectado en la región de Pilar de Goiás mostró las tasas de inhibición más bajas en comparación con las otras regiones del estudio. La propiedad inhibitoria se observa a través de los halos (8-29 mm) contra la acción de inhibición fúngica de los aceites esenciales de B. rufa en la tabla 2.
Los resultados de este estudio, considerando el AE de la flor deB. rufa, son compatibles con los observados por otros autores como Castro y Lima(16) que evaluaron los aceites esenciales de O. odorifera y R. officinalis, los que se ha demostrado que contienen compuestos que son sensibles a diferentes cepas de C. albicans y resistentes a C. tropicalis. Lima y otros(14) obtuvieron una alta eficiencia de inhibición del crecimiento en especies de Candida usando AE de C. zeylanicum y P. boldus alrededor del 58 % de CIM. Sin embargo, todos los aceites esenciales no se comportan igual, los estudios que evaluaron el AE de C. limon, E. citriodora y R. officinalis demostraron una baja actividad fungistática en las cepas analizadas. El AE de E. uniflora mostró una baja actividad de inhibición para las cepas de Candida, sin embargo, demostró actividad antifúngica para C. krusei. En este estudio se observó resistencia a la cepa C. tropicalis, como también lo observaron Lima y otros.(14)
Se puede concluir que el AE de la flor Bauhinia rufa (Bong.) Steud manifiesta un buen contenido de aceite esencial y los resultados de su actividad antifúngica para las cepas de Candida evaluadas lo sitúan como un posible candidato para desarrollar nuevos antifúngicos.
AGRADECIMIENTOS
Al Instituto Federal Goiano, Campus de Rio Verde; la Universidad Federal de Goiás, Campus Samambaia; la Universidad Federal de Jataí, Goiás; a los laboratorios de Biomoléculas y Bioensayos, Química Tecnológica, Química de Productos Naturales y, Aguas y Efluentes; y FAPEG por la beca de Maestría en Agroquímica para el autor Antonio.
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Conflicto de intereses
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Contribuciones de los autores
Antonio Carlos Pereira de Menezes Filho: conceptualización; curación de datos; análisis formal. análisis estadístico; redacción - borrador original.
Dâmaris Hadassa Rangel Fonseca Bessa: conceptualización, investigación.
Carlos Frederico de Souza Castro: adquisición de fondos; administración del proyecto; redacción - revisión.
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