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PRODUCTOS NATURALES
Obtención de un extracto seco de Punica granatum (granada) mediante secado por aspersión
Obtaining a dry extract from punicagranatum(pomegranate) by spray drying
Jorge Enrique Rodríguez-Chanfrau,I Orestes Dario López-Hernández,II Addis Bellman-Menéndez,III Antonio Nogueira-MendozaIII
I Facultad
de Química. Universidad de la Habana. La Habana. Cuba.
II
Facultad de Ciencias e Ingeniería de Alimentos. Universidad Técnica
de Ambato. Ecuador.
III
Centro de
Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). La Habana. Cuba.
RESUMEN
Objetivo:
obtener extracto seco mediante secado por aspersión del extracto hidroalcohólico
de Punica granatum a escala de banco e industrial.
Métodos:
se fabricaron lotes de extracto hidroalcohólico a escala de banco e industrial.
A partir de ellos se elaboraron lotes de extracto seco mediante la técnica
de secado por aspersión, evaluándose el rendimiento, contenido de
humedad y contenido de polifenoles totales. Los resultados fueron comparados
estadísticamente. Además se le realizó al extracto seco un estudio
de toxicidad.
Resultados:
el análisis de los lotes de extractos secos demostraron que no existían
diferencias signicativas entre ellos. Los rendimientos en todos los casos fueron
superiores al 70 % en la escala de banco y 85 % en la escala industrial, mientras
que el contenido de polifenoles totales fue superior al 25 %. El estudio de
toxicidad demostró que el extracto seco no es tóxico a la dosis ensayada.
Conclusiones:
el proceso de secado es homogéneo, reproducible y no tóxico.
Palabras claves: Punica granatum; Pomegranate; extracción hidroalcohólica; secado por aspersión; toxicidad aguda; granada.
ABSTRACT
Objective: T
o obtain a dry extract by spray drying from the punicagranatum hydroalcoholic
extract on bench and industrial scale.
Method:
Hydroalcoholic extract batches on bench and industrial scales were produced.
Dry extract batches by spray drying from hydroalcoholic extract were then produced.
Yield, humidity and total polyphenol contents were evaluated. The results were
statistically compared. A toxicity study was conducted in the dry extract.
Results:
The analysis of dry extract batches proved that there was no significant difference
among them. The yields in all the cases were higher than 70 % on bench and 85%
on industrial scale, respectively whereas the polyphenol content was over 25%.
The toxicity study demonstrated that the dry extract is not toxic at the tested
dose.
Conclusions:
The drying process is homogeneous, reproducible and non-toxic.
Keywords. Punicagranatum; Pomegranate; hydroalcoholic extraction; spray drying ; acute toxicity; Granate.
INTRODUCCIÓN
Punica granatum Lin (pomegranate) pertenece a la familia de las Punicaceas y es originaria de la región mediterránea. Su fruto, conocido popularmente como granada en muchas partes del mundo, es rico en polifenoles, incluyendo antocianinas (mono- y di-glicósidos de cianidina, pelargonidina y delfinidina) y taninos hidrolizables (galotaninos, elagitaninos, y los galagilésteres). Específicamente esta fruta es rica en punicalagina y punicalina, componentes a los que se les atribuyen las principales actividades farmacológicas, debido a la presencia de grupos OH.1-3 Diversos estudios demuestran que posee actividad antioxidante, antiparasitaria, antimicrobiana, anticatarral, antiinflamatorios, entre otros.1,4-9
Previamente se reporta un proceso a escala de laboratorio para extraer los polifenoles totales presentes en esta fruta donde se establecieron como condiciones óptimas un tiempo de extracción de 72 h, relación droga menstruo de 1:20 y concentración alcohólica del 50 (v/v).10 El objetivo de este trabajo fue obtener el extracto seco mediante secado por aspersión del extracto hidroalcohólico de Punica granatum a escala de banco e industrial.
MÉTODOS
MATERIAL VEGETAL
Las frutas maduras fueron colectadas en la Estación Experimental de Plantas Medicinales Dr. Juan Tomás Roig, en la provincia de Artemisa, Cuba, en Julio del 2013. Una muestra de la especie (ROIG 4681) se depositó en el herbario de la propia estación experimental. Las frutas fueron lavadas con abundante agua y desinfectadas con solución de hipoclorito de sodio al 2 % durante 15 minutos. Se dejaron escurrir al aire y se molieron hasta tamaño de partículas menores a 200 μm.
PREPARACIÓN DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO A ESCALA DE BANCO
En la escala de banco se empleó un reactor de vidrio de 5 L de capacidad, provisto de un agitador de propela marina y un sistema de calentamiento. La filtración se realizó al vacío empleando un embudo Buchner de porcelana, con área de filtración de 1,06 x 10-2m 2, medio filtrante lona (algodón XX, 2 mm) (Filtronic, Brasil) y presión constante (9,99 x 104 kg/m.s2), para eliminar el residual vegetal y concentrado hasta obtener una concentración de sólidos totales mayor al 10 %. Se elaboraron tres lotes de 2 L cada uno, manteniendo los parámetros establecidos en estudios previos por Rodríguez y col.10
PREPARACIÓN DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO A ESCALA INDUSTRIAL
La pulpa de masa de las frutas molidas se trasvasó a un reactor de acero inoxidable de tipo tanque agitado de 250 L de capacidad, provisto de un agitador de propela marina y un sistema de calentamiento y extracción de gases. Se adicionaron 100 L de una mezcla hidroalcohólica al 50 % en una proporción 1:20 masa/volumen y se dejó macerar durante 72 h con agitación de 15 min cada cierto tiempo. Transcurrido el tiempo de maceración, el extracto fue filtrado a través de un filtro vertical al vacío de 200 L de capacidad (Sparkle, Italia), con un área de filtración de 0,2642 m2 y como medio filtrante lona (algodón XX, 2 mm) (Filtronic, Brasil) para eliminar el residual vegetal y concentrado hasta obtener una concentración de sólidos totales mayor al 10 %. Se elaboraron tres lotes, manteniendo los parámetros establecidos en estudios previos por Rodríguez y col.10
PREPARACIÓN DEL EXTRACTO SECO
El extracto concentrado fue secado por aspersión. El secado por aspersión a escala de banco se realizó en un equipo secador de spray Büchi B 191, Suizo, de 5 kg/h de capacidad. La temperatura de entrada del aire fue de 150 °C y la temperatura de salida del aire fue de 90 ºC.11 El secado por aspersión a escala industrial se realizó en un equipo secador de spray industrial Sam Young, Korea, de 36 kg/h de capacidad. La temperatura de entrada del aire fue de 150 °C y la temperatura de salida del aire fue de 90 ºC.11 En ambos casos el extracto seco obtenido en cada lote fue almacenado en bolsas de polietileno hasta su análisis.
MÉTODOS DE ENSAYOS
Las determinaciones en los extractos de sólidos totales y pH se realizaron según lo establecido por la Farmacopea Brasileña.1 2 Las determinaciones del contenido de polifenoles totales se realizaron aplicando lo establecido por Rodríguez y col.10
En los extractos
secos el contenido de humedad se realizó acorde a lo establecido por la
Farmacopea Brasileña 12, mientras que el contenido de polifenoles
totales se determinó a partir de una modificación al método descrito
por Rodríguez y col1 0 y que consiste en: pesar exactamente
100 mg del extracto seco, trasvasarlos a un matraz aforado de 100 mL, añadir
25 mL de agua destilada, disolver y completar volumen con agua destilada. De
esta solución tomar exactamente 2 mL, trasvasarlos a un matraz aforados
de 25 mL de capacidad, adicionar
2 mL de agua destilada, 2 mL de solución desarrolladora de color (tungtato
de sodio y ácido fosfomolibdico en ácido fosfórico al 85 %),
agitar y dejar en reposo por 5 minutos.
Posteriormente adicionar 1 mL de solución de carbonato de sodio al 20 %, agitar por unos segundos y llevar a volumen con agua destilada. Mezclar y leer la absorbancia a una longitud de onda de 700 nm antes de transcurrir 10 minutos, empleando como blanco agua.
Como estándar de referencia se utiliza ácido tánico de la siguiente manera: preparar una curva de calibración a concentraciones entre 5 y 50 µg/mL a partir de una solución madre de ácido tánico de concentración de 125 µg/mL. Trasvasar el volumen correspondiente a cada punto de la curva a un matraz aforado de 25 mL, adicionar 2 mL de agua destilada, 2 mL de solución desarrolladora de color, agitar y dejar en reposo por 5 minutos. Luego adicionar 1 mL de solución de carbonato de sodio al 20 %, agitar y completar el volumen con agua destilada. Mezclar y leer la absorbancia a una longitud de onda de 700 nm antes de transcurrir 10 minutos, empleando como blanco agua.
ESTUDIO TOXICOLÓGICO
Con el objetivo de conocer si el extracto seco presentaba toxicidad se realizó el ensayo de toxicidad aguda oral al lote denominado L-13001, según las normas de aseguramiento de calidad establecidas en el Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM).
Animales: se emplearon ratas hembras Wistar con 150 a 200 g de masa corporal, procedentes de la colonia del Laboratorio de Control Biológico del CIDEM. Las mismas fueron mantenidas en cajas de policarbonato con acceso ad libitum al agua y alimentos (dieta estándar CM 1000, Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio, La Habana, Cuba). Los animales estuvieron bajo un régimen de luz/oscuridad de 12-12 h y una a temperatura ambiental controlada de 20±2 °C. Los tratamientos se realizaron por vía oral. El cuidado de los animales se realizó de conformidad con el Consejo Canadiense para las Pautas de Cuidado de Animal. Previamente el protocolo de estudio fue evaluado y aprobado por el Comité de Ética del CIDEM (TOX/05/13). Los animales permanecieron durante 7 días en cuarentena antes de comenzar el estudio. Toda la información referida al estudio se conserva en el área de aseguramiento de la calidad de la UEB Control Biológico del CIDEM.
Ensayo de toxicidad aguda : estudios realizados con anterioridad demostraron la no toxicidad de los extractos de esta fruta13-17 y según lo establecido en las normas de aseguramiento de calidad del CIDEM para la escala tecnológica, se realizó un estudio aplicando el método agudo de toxicidad de clases. Para ello, se incluyeron en el estudio seis animales que se dividieron aleatoriamente en dos grupos (tres ratas por cada grupo). El primero se trató con la dosis límite de 2 000 mg/kg de peso y el otro con agua destilada.
Los animales fueron identificados individualmente con ácido pícrico para la dosificación de acuerdo a su peso corporal. La administración se realizó por vía oral mediante cánula intragástrica. La comida se retiró 16 h antes de la administración del extracto. En base a los polifenoles totales se utilizó un factor de volumen de 7,04 mL/Kg, Las ratas fueron dosificadas con 20 mL/kg de peso de solución acuosa que contenía 10 % (w/v) de extracto seco. La dosis fue de 0,37 mg de polifenoles/kg de peso. Esta dosis se corresponde a la dosis límite descrita para los ensayos de toxicidad aguda.18
Todas las ratas se supervisaron continuamente durante las primeras 24 h (0,30, 1, 4, 6, 8, 12 y 24 h) después de dosificar y se registró cualquier síntoma tóxico. El estudio se continuó durante 14 días. Los animales fueron examinados diariamente para evaluar las principales funciones sensoriales y motoras, así como la aparición de signos de toxicidad retardada acorde a lo establecido en la OECD 423. 18 El peso corporal se determinó semanalmente para evaluar cambios del peso corporal.
Al finalizar este período se procedió al sacrificio por administración intraperitoneal de 80 mg/kg de tiopental sódico (ERON SA, Cuba) para realizarles la autopsia. Los órganos y tejidos (corazón, riñón, pulmón, estómago, hígado, bazo, timo, intestinos) fueron observados cuidadosamente a fin de determinar cambios groseros en su composición. Ante cualquier alteración macroscópica detectada se procedió a la toma de muestra para realizar el análisis histopatológico.18
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
La comparación de los lotes fue realizada mediante un análisis de varianza (ANOVA) para conocer si existían diferencias significativas entre los mismos. Los resultados toxicológicos fueron comparados estadísticamente mediante un test t de student para determinar diferencias entre grupos. En ambos casos los resultados fueron considerados significativos para p<0,05.
RESULTADOS
ESCALA DE BANCO
Se obtuvieron en este proceso tres lotes de extracto hidroalcohólico de coloración amarilla con olor característicos. En todos los casos el pH de los mismos fue de alrededor de 5, mientras que, los contenidos de sólidos totales oscilaron entre 0,7 y 0,8 %. Se obtuvo además, un contenido alcohólico superior al 40 %, lo que consideramos adecuados para esta tipo de proceso y escala (tabla 1).
Se comprobó que el contenido de polifenoles totales extraído era de alrededor de los 32 mg/ 100 mL, lo cual representa entre el 0,5 y 0,6 % respecto al material vegetal empleado en el proceso de extracción.
Un análisis estadístico mediante ANOVA demostró que no existían diferencias significativas entre los resultados obtenidos en el contenido de polifenoles totales para cada lote (p=0,1142), lo que indicaba que existe reproducibilidad y homogeneidad entre los lotes.
ESCALA DE INDUSTRIAL
Al igual que en el proceso desarrollado a escala de banco, el lote obtenido a escala piloto era un extracto hidroalcohólico de color amarillo y olor característico. En todos los casos el pH de los mismos fue de alrededor de 5; los contenidos de sólidos totales oscilaron entre 0,6 y 0,7 % y el contenido alcohólico fue superior al 40 % (tabla 1). El contenido de polifenoles totales fue de alrededor de 30,6% (m/v), que representa alrededor del 0,4 % (m/m) respecto al material vegetal de partida, ligeramente inferior al obtenido a escala de banco.
El análisis estadístico mediante ANOVA demostró que no existían diferencias significativas entre los resultados obtenidos en el contenido de polifenoles totales para cada lote (p=0,1058), lo que indicaba que existe reproducibilidad y homogeneidad entre los lotes.
OBTENCIÓN DE EXTRACTO SECO
A partir de los extractos hidroalcohólicos concentrados se realizó el proceso de secado por aspersión. Los resultados mostrados en la tabla 2 muestran que en la escala de banco los rendimientos alcanzados fueron de alrededor del 71 %, lo que se considera adecuado teniendo en cuenta la escala de trabajo y el tipo de equipamiento utilizado provisto de un sistema de atomización tipo tobera. Mientras que, en la escala industrial donde se utilizó un equipo con sistema de atomización tipo disco los rendimientos fueron superiores al 85 %.
En ambas escalas se obtuvieron lotes de extractos secos con características amorfas, de color carmelita, que contenían polifenoles totales por encima del 25 % y contenidos de humedad residual por debajo del 12 % (tabla 2).
ENSAYO TOXICOLÓGICO
El ensayo toxicológico no mostró signos tóxicos ni mortalidad a la dosis administrada. El análisis del peso corporal reveló un incremento fisiológico proporcional en el tiempo similar para los grupos tratado y control. Se observó además que la ganancia de peso corporal de los animales tratados fue ligeramente inferior pero estadísticamente significativa con respecto a los grupos controles, sin embargo, esto no parece ser un signo tóxico. En la autopsia realizada no se observaron alteraciones macroscópicas en los órganos y tejidos analizados posterior a los 14 días de administradas la dosis. (Fig.)
DISCUSIÓN
La granada (Punica granatum) generalmente se consume como fruta natural o en jugos.1-3 Por otro lado, aunque la extracción y secado de componentes bioactivos a partir de fuentes naturales son operaciones clásicas en la industria alimenticia y farmacéutica, pocos estudios se refieren a la obtención de extractos secos a partir de esta fruta.
Los resultados de los análisis de los lotes de extracto hidroalcohólico a las escalas de banco e industrial son similares a los alcanzados en los estudios a escala de laboratorio, con un contenido de polifenoles totales de alrededor del 30,7 %.10 A su vez están comprendidos dentro del rango de valores reportados internacionalmente para extractos hidroalcohólicos de esta fruta, elaborados en condiciones similares a las de este trabajo.19 Estos resultados corroboran que el procedimiento es adecuado y escalable en las en las condiciones industriales cubanas.
Se confirma además que los polifenoles totales son los compuestos mayoritarios en el extracto. A ellos se les atribuyen las principales acciones farmacológicas reportadas en la literatura, específicamente al punicalagin y el ácido elágico.3-5,7
Por otro lado, la adecuación del proceso de secado por aspersión propuesto por López y col11 a las condiciones de trabajo descritas en este artículo, confirmó que es posible la obtención de extractos secos a partir de extractos hidroalcohólicos de esta fruta, con buenos rendimientos. El estudio estadístico demostró que no existían diferencias significativas entre los resultados, lo que confirma que el método de secado establecido es homogéneo y reproducible. Esto permite afirmar que es factible el uso de esta tecnología para la obtención de extractos secos, que pudieran ser empleados como principio activo en la posterior elaboración de formas nutracéuticas terminadas o alimentarias con mayor uniformidad en lo referente a los contenidos de polifenoles totales.20
El estudio de toxicidad aguda demostró que el extracto seco no produjo toxicidad por vía oral, lo que garantiza seguridad en su empleo a la dosis ensayada en esta especie. Estos hallazgos son importantes y corroboran los resultados alcanzados por diversos autores en estudios toxicológicos realizados con jugos o extractos líquidos obtenidos a partir de esta fruta.16,17,21
Se conoce que la cáscara del fruto comprende aproximadamente el 40 % del peso total del fruto, con un alto contenido de compuestos polifenólicos, en especial los taninos. La punicalagina es al elagitanino más abundante (constituye alrededor del 85 % de los taninos presentes).22 La toxicidad de este compuesto fue evaluada en ratas y se, demostró que no es tóxico, aspecto confirmado por análisis histopatológico de los órganos de los animales utilizados en el estudio.16
Se observó que la ganancia de peso corporal en los animales tratados fue ligeramente inferior a los controles. Otros estudios han descrito resultados similares, pero pocos han sido discutidos.16,17 Lei y col23 reportaron que el empleo de un extracto liofilizado de la fruta en ratones hiperlipidicos obesos, provocaba una disminución significativa del peso, debido a que los derivados del ácido elárgico, disminuían el apetito y la absorción intestinal de la grasa por inhibición de la actividad pancreática. Este hecho pudiera justificar las diferencias significativas entre tratados y controles observado en el estudio.
Se obtuvo un extracto seco mediante secado por aspersión a partir de extracto hidroalcohólico de la fruta Punica granatum y se demostró que el mismo es homogéneo, reproducible y no tóxico.
CONFLICTO DE INTERESES
No declarado por los autores
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Recibido: 12 de
julio de 2015
Aprobado:
22 de marzo de 2016
Jorge Enrique Rodríguez Chanfrau. Facultad de Química. Universidad de la Habana. Zapata entre G y Carlitos Aguirre. Vedado. La Habana, Cuba. Dirección electrónica: jerodriguez@fq.uh.cu, Jerodriguez354@gmail.com
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