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PRODUCTOS NATURALES
Composición química y actividad antibacteriana del aceite esencial de Minthostachys mollis Griseb contra el Staphylococcus aureus
Chemical composition and antibacterial activity of the essential oil of Minthostachys mollis Griseb against Staphylococcus aureus
Mercedes Campo
Fernández1
Daysi
Lorena Ambuludí Fárez1
Nelly Cecilia Cepeda Roblez1
Ingrid Márquez Hernández1
Diana San Martín Galván1
Osmany Cuesta Rubio1
1Universidad Técnica de Machala, Vía Machala Pasaje, Ecuador.
RESUMEN
Introducción:
Minthostachys mollis Griseb es un arbusto aromático
que crece en América Latina y se reconoce como una planta productora de
aceites esenciales de valor medicinal. Tradicionalmente, se utiliza como digestivo,
carminativo, antiespasmódico, en infecciones respiratorias, en dolores
musculares y para el reumatismo.
Objetivo:
Evaluar la composición química y actividad antibacteriana in
vitro contra Staphylococcus aureus, de los aceites esenciales obtenidos
a partir de la mezcla exclusiva de hojas y flores (Mp1) y de las partes aéreas
(Mp2) de la especie M. mollis que crece en Quito, Ecuador.
Métodos:
Se trabajó con la especie M. mollis, (Mp 1 y Mp 2). Se obtuvieron
los aceites esenciales por el método de hidrodestilación, los que
fueron analizados mediante cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría
de masas (CG-EM). Se realizó una evaluación preliminar de la actividad
antimicrobiana del aceite frente a la cepa S. aureus.
Resultados:
Se obtuvo el aceite esencial con un rendimiento de 0,41 % para Mp 1 y de
0,21 % para Mp2. El estudio por CG-EM permitió la identificación de
terpenoides, fundamentalmente del tipo monoterpenos y resultaron estos los componentes
mayoritarios en Mp1, el neomentol (32,34 %), pulegona (28,42 %) y mentona (19,32
%); mientras que en Mp2 predominan el geraniol (24,93 %) y el citronelol (14,84
%). Se demostró, preliminarmente, la actividad antibacteriana contra S.
aureus.
Conclusiones:
Existen variaciones cualitativas y cuantitativas atribuidas, generalmente,
a factores intrínsecos y extrínsecos. La mezcla de metabolitos en
el extracto justifica la actividad antimicrobiana del aceite esencial.
Palabras clave: Minthostachys mollis Griseb, aceites esenciales, hidrodestilación, CG-EM, Staphylococcus aureus.
ABSTRACT
Introduction:
Minthostachys mollis Griseb is an aromatic bush that grows in
Latin America and is recognized as a producing plant of essential oils with
medicinal value. Traditionally, it is used as digestive, carminative, antispasmodic,
respiratory infections, muscle aches and rheumatism.
Objective:
To evaluate the chemical composition of essential oils obtained from the mixture
of leaves and flowers (Mp1) and the aerial parts (Mp2) of the species growing
up in Quito, Ecuador. To assess in vitro antibacterial activity of the
essential oils against Staphylococcus aureus.
Methods:
The species M. mollis (Mp1 y Mp2) were used. Essential oils were obtained
by hydrodistillation method, and analyzed by gas chromatography-mass spectrometry
(GC-MS). The preliminary evaluation of the antimicrobial activity of the oil
was performed against S. aureus through its inhibition halos.
Results:
The yield of the essential oil of Mp 1 was 0.41 %, while for Mp 2 was 0.21 %.
The study by GC-MS allowed identification of metabolites from the family of
monoterpenes. The main components in Mp 1 were neomenthol (32.34 %), pulegona
(28.42%) and menthone (19.32 %); while, geraniol (24.93 %) and citronellol (14.84
%) are predominant in Mp2. It was preliminarily demonstrated antibacterial activity
of essential oils against S. aureus.
Conclusions:
There are qualitative and quantitative variations, attributed generally to intrinsic
and extrinsic factors. The mixture of metabolites in the extract justifies the
antimicrobial activity of essential oil.
Keywords: Minthostachys mollis Griseb, essential oil, hydrodistillation, CG-EM, Staphylococcus aureu.
INTRODUCCIÓN
Desde la antigüedad el hombre ha estado en contacto directo con la naturaleza, al utilizar las plantas como principal alternativa para tratar diversas enfermedades, lo que le ha permitido acumular un rico acervo de conocimientos de las especies empleadas. Así mismo, en aquellos contextos culturales, donde la población de escasos recursos económicos tiene dificultad para recibir atención médica y para tener acceso a medicamentos, se recurre a la medicina tradicional con una mayor incidencia.1-3
Existe gran variedad de plantas que han sido utilizadas por la población de manera ancestral para tratar diversas enfermedades, sin embargo, su eficacia aún no ha sido demostrada científicamente. Con el objetivo de validar estas preparaciones empíricas, se realizan estudios fitoquímicos que permiten identificar la composición química presentada por las diferentes especies vegetales.4
La especie M. mollis es un arbusto aromático nativo de los páramos del Ecuador, aunque crece en América Latina. Las hojas, se preparan como infusión y se utilizan, tradicionalmente, como digestivo, carminativo, antiespasmódico, así como en el tratamiento de infecciones respiratorias y urinarias. Las decocciones de las hojas se emplean contra dolores musculares y para el reumatismo. De la especie se puede obtener aceite esencial, cuyo alto porcentaje de monoterpenos oxigenados como mentona y pulegona sobresale como característica esencial, los que han sido previamente reportados como componentes privativos de diferentes quimiotipos.5-11
En Ecuador existen aún muchas especies de uso medicinal tradicional que carecen de investigación, por lo que las tendencias actuales promueven estudios fitoquímicos de estas para contribuir a su validación científica. Tomando en consideración que no existen estudios químicos de la especie M. mollis procedente de Quito (región sierra), el presente trabajo se propuso evaluar la composición química y actividad antibacteriana in vitro contra Staphylococcus aureus, de los aceites esenciales obtenidos a partir de la mezcla exclusiva de hojas y flores (Mp1) y de las partes aéreas (Mp 2) de la especie M. mollis que crece en Quito, Ecuador.
MÉTODOS
Se trabajó con la especie vegetal M. mollis, cuya identificación taxonómica fue realizada en el Herbario Alfredo Paredes (QAP), de la Universidad Central del Ecuador.
La especie M. mollis fue recolectada en la Provincia de Pichincha (Quito), separándose, para su estudio, las hojas y flores a lo que se denominó Mp 1 y Mp 2, a las partes aéreas de la planta (hojas, flores y tallos). En ambos casos se eliminaron aquellas partes que estaban amarillentas, secas o deterioradas por insectos.
El material lavado y fresco se destinó a la extracción del aceite esencial.
La extracción del aceite esencial se efectuó a partir de las dos materias primas, mediante el método de hidrodestilación.12 El proceso se realizó al emplear en cada extracción 100 g de droga y 1,2 L de agua destilada. La droga vegetal fue sometida a destilación durante dos horas. Los aceites esenciales fueron separados mediante decantación y posterior secado con sulfato de sodio anhidro. Para su conservación se almacenaron en viales ámbar a 4 ºC, hasta realizar los análisis pertinentes.
Al aceite esencial
obtenido se le adicionó sulfato de sodio anhidro para eliminar, totalmente,
la presencia de agua. Debido al rendimiento bajo del aceite, no se procedió
a filtrar, sino que se empleó una pipeta pasteurs para trasvasarlo en un
frasco color ámbar y de esta forma evitar la posible descomposición
por efecto de la luz.
ANÁLISIS POR CROMATOGRAFÍA GASEOSA ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS (CG-EM)
Se empleó un cromatógrafo de gases Agilent serie 6890, equipado con un detector selectivo de masas, serie 5973N. Se inyectaron 0,2 µL de la muestra, siendo la temperatura del inyector 280 ºC. La separación se realizó en una columna HP-Ultra 2 de 12 m x 0,20 mm x 0,33 µm. Como gas portador se utilizó helio a un flujo de 0,8 mL/min. La rampa de temperatura empleada fue de temperatura inicial 60 ⁰C por 2 min y fue incrementado desde 4 ⁰C/min hasta 100. Posteriormente se incrementó desde 10 ⁰C/min hasta 250 ⁰C y se mantuvo por 12 min. El tiempo de corrida fue de 39 min.
El espectrómetro de masas fue operado en el modo de impacto electrónico (IE) a 70 eV, con una temperatura de la fuente iónica de 230 ºC y la temperatura del quadrupolo 150 °C. La detección se realizó en el modo de barrido total desde 45-600 uma.
Las estructuras
químicas fueron asignadas según la base de datos Wiley 275. La cuantificación
relativa de los compuestos se realizó por normalización interna del
área bajo la curva de cada pico cromatográfico.
ESTUDIO ANTIBACTERIANO
A partir de un cultivo puro de bacteria de S. aureus, se seleccionaron varias colonias y fueron suspendidas en 9 mL de caldo Bad Peptone e incubadas a 36 oC durante 48 horas. Posteriormente, se procedió a sembrar en agar Manitol a partir del tubo de enriquecimiento por siembra en estrías, incubando a 36 ºC durante 24 horas.
Se seleccionaron de cuatro a cinco colonias de las sembradas anteriormente y se transfirieron a un tubo que contenía 9 mL de caldo apropiado (Bad Peptone). Se incubó el caldo a una temperatura entre 35 °C a 37 °C por 24 horas, hasta que alcanzó la turbidez adecuada según la escala de Mc Farland.13
Posteriormente, se sembró en las placas agar Mueller Hinton el inóculo tomado del cultivo. Se sumergió el hisopo en el caldo de cultivo (108), se escurrió el exceso de líquido sobre la pared interior del tubo y se estrió en el agar de la placa al deslizar el hisopo suavemente por su superficie en zig-zag. Este proceso se realizó por triplicado.14
La evaluación de la actividad antimicrobiana se realizó por el método difusión en pozo. En el medio Mueller Hinton, se hicieron los pocillos sobre la superficie de los agares. En cada placa Petri se realizaron 3 pocillos aplicando las muestras correspondientes: Pocillo 1: ciprofloxacino 500 mg (control +), Pocillo 2: agua destilada (control -), Pocillo 3: Mp 1, Pocillo 4: Aceite Mp 2. Cada estudio se realizó por triplicado.15 Luego de la aplicación se dejaron reposar por 30 minutos. Posteriormente, se incubaron a 37 °C por 24 horas y se efectuó la lectura según el método Kirby-Bauer. Se midió el diámetro del halo en la zona de inhibición, y se consideró el diámetro del orificio.13,15-17
RESULTADOS
TRATAMIENTO POSCOSECHA DEL MATERIAL VEGETAL
Luego del proceso de selección, lavado y disminución del tamaño de partícula de la droga, se logró un material vegetal con las condiciones apropiadas para someterlo a los procesos de extracción.
OBTENCIÓN DEL ACEITE ESENCIAL
La extracción se les realizó a dos materias primas por separado y se obtuvo en ambos casos, un aceite esencial translúcido, con una muy leve tonalidad amarilla y un fuerte aroma mentolado. El rendimiento ofrecido en el estudio fue de 0,41 % para la Mp 1, mientras que para la Mp 2 fue de 0,21 %.
ANÁLISIS DEL ACEITE ESENCIAL POR CROMATOGRAFÍA GASEOSA ACOPLADA A
ESPECTROMETRÍA DE MASAS (CG-EM)
En la figura 1 pueden apreciarse los cromatogramas gaseosos correspondientes a ambos aceites esenciales obtenidos (A: Mp 1; B: Mp 2).
Para cada una de estas señales se realizó el espectro de masas por impacto electrónico, identificándose mediante la base de datos los metabolitos presentados en la tabla 1 y figura 2.
DETERMINACIÓN IN VITRO DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE ACEITES ESENCIALES
La figura 3 muestra el resultado comparativo
de la medición de los halos de inhibición correspondientes a Mp 1
y Mp 2, frente a la cepa de S. aureus.
DISCUSIÓN
Para la obtención del aceite esencial se trabajó con la droga vegetal fresca: Mp 1 y Mp 2, a las que se les disminuyó el tamaño de partícula de forma manual, con el fin de aumentar los rendimientos de la extracción. La idea de trabajar las dos materias primas vegetales por separado, fue para poder valorar el aporte químico de cada una de ellas.
El proceso se desarrolló durante dos horas, período tras el cual no se observó incremento del volumen de aceite.
El rendimiento obtenido para el aceite esencial resulta ser mayor con las hojas y flores (Mp 1 - 0,41 %) que cuando se extrae de las partes aéreas de la planta (Mp 2 - 0,21 %). Aunque los rangos obtenidos son aceptables para aceites esenciales, estudios anteriores han reportado, por igual método, rendimientos de 1,2 % 9. Es importante señalar que el rendimiento de aceite esencial, suele ser bastante bajo, frecuentemente menos de 1 %.18,19
Por otra parte, la variación en el rendimiento de aceites esenciales depende de un conjunto de factores tales como: características edafo-climáticas, época de recolección y condición del material vegetal (fresco o seco) y por lo general los mayores porcentajes se alcanzan en drogas frescas.
Resultaría
interesante en trabajos futuros evaluar la dinámica de acumulación
para lograr que la droga se recolecte en la época donde el rendimiento
de aceite esencial sea el mayor.
ANÁLISIS DEL ACEITE ESENCIAL POR CROMATOGRAFÍA GASEOSA ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS (CG-EM)
Dentro de los métodos de caracterización más empleados para el estudio químico de los aceites esenciales se encuentra la técnica de CG-EM. Existen múltiples trabajos relacionados con el tema, por lo que las bases de datos almacenan una diversidad de espectros de masas de los compuestos químicos que integran la compleja composición química de estos, lo cual hace más fácil la interpretación de los espectros.
En la figura 1 puede apreciarse a simple vista como difieren químicamente el aceite obtenido de las dos materias primas, donde es más compleja la apariencia cromatográfica correspondiente a la Mp 2. Lógicamente, si bien el tallo no suele ser un órgano donde se almacenen cantidades elevadas de aceite esencial, si pudiera aportar metabolitos químicamente diferentes y por consecuencia influir en la actividad biológica deseada.
Luego de realizar el espectro de masas por impacto electrónico, la base de datos facilitó la identificación de diversos metabolitos (tabla 1), mucho de ellos pertenecientes a la familia de los compuestos terpénicos y en particular a los monoterpenoides. La estructura de los mayoritarios, se muestra en la figura 2.
Compuestos como el 3-octanol, acetato de geranilo, acetato de timol, mentona, neomentol, óxido de cariofileno, pulegona, espatulenol, timol y β-cariofileno, han sido también identificados en la especie M. mollis, procedente de la región de Zaruma.6
Al realizar una revisión de otros estudios a partir del aceite esencial de la especie M. mollis por CG-EM, puede apreciarse (tabla 2) que la pulegona y la mentona suelen ser los componentes mayoritarios. En el presente estudio el componente mayoritario en la Mp 1 es el neomentol (32,34 %), seguido de la pulegona (28,42 %) y de la mentona (19,32 %). Sin embargo, para la Mp 2, aunque dichos metabolitos se mantienen, se identificaron muchos otros aportados por el tallo. En este último caso el componente mayoritario resulta ser el geraniol (24,93 %), seguido del citronelol (14,84 %). Mentona, pulegona y neomentol, están presentes, pero en menor porcentaje.
Al contrastar
los resultados obtenidos con lo que informa la literatura científica, puede
apreciarse que la composición química de la misma especie cultivada
en diferentes regiones varia apreciablemente, tanto desde el punto de vista
cualitativo como cuantitativo. Este suceso no es nada particular pues la diversidad
de metabolitos presentes en un aceite esencial puede cambiar según el estado
vegetativo y la edad de la especie, lo cual guarda estrecha relación con
la época del año en se efectúe la recolección. Además,
sobre la composición química del aceite esencial ejerce gran influencia
el clima donde crece la especie, la hora del día en que se recolecten,
entre otros aspectos.20
DETERMINACIÓN IN VITRO DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE ACEITES ESENCIALES
En este caso se realizó una evaluación preliminar de la actividad antimicrobiana de ambas materias primas, frente a la cepa de S. aureus, con el fin de validar científicamente las propiedades terapéuticas de esta planta utilizada como medicina popular en Ecuador, sobre todo, para enfermedades respiratorias.
Como puede apreciarse en la figura 3, los halos de inhibición de la Mp 1 promediados, dan un valor de 25 mm, mientras que para la Mp 2 el valor promedio de dichos halos fue de 23 mm. Si se comparan con los obtenidos para el control negativo, evidentemente ambos aceites esenciales presentan sensibilidad, según el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) de 2000, contra la cepa objeto de estudio, pero a su vez resulta inferior al obtenido para el ciprofloxacino, antibiótico que posee actividad in vitro contra un amplio rango de microorganismos Gram (+) y Gram (-).
Los resultados a simple vista sugieren que el aceite esencial -obtenido de las hojas y flores (Mp 1)- posee un mayor efecto contra las cepas de S. aureus. Este aceite se diferencia en los marcadores químicos (neomentol, pulegona y L-mentona) obtenidos a partir de las partes aéreas de la planta (Mp 2).
Existen ensayos in vitro que han mostrado un efecto inhibidor significativo contra las bacterias Gram positivas y Gram negativas, especialmente Bacillus subtilis y Salmonella typhi. Evidencias diversas sugieren que la trans-mentona, pulegona y D-germacreno, juegan un papel significativo en la actividad antibacteriana del aceite esencial de M. mollis.9
Diversos estudios realizados con el aceite esencial de esta especie han demostrado actividad contra diversos hongos como la Candida albicans,14 sugiriéndose que son los monoterpenos los responsables de dicha actividad. Estos estudios se sugieren para etapas posteriores de trabajo.
Los aceites esenciales y sus componentes mayoritarios poseen un amplio espectro de actividades biológicas, en particular antimicrobiana.21 Se ha encontrado que la actividad antimicrobiana presentada por los aceites esenciales es debida, en gran medida, a la presencia de terpenoides, en primer lugar, los que contienen grupos hidroxilos, luego los que poseen aldehídos y por último los que tienen grupos cetónicos.22
Los estudios realizados contribuyen a validar la eficacia del uso tradicional de una especie que crece en Ecuador y que la población utiliza con diversos fines medicinales, sobre todo, para las vías respiratorias y digestivas.8
La búsqueda y caracterización de componentes bioactivos de vegetales, así como la investigación de sus propiedades farmacológicas, son de crucial importancia en la industria farmacéutica, para el desarrollo racional de fármacos inocuos y efectivos para el tratamiento y la prevención de enfermedades.
Se sugiere realizar el estudio antimicrobiano del aceite esencial de manera más precisa, para determinar la dosis mínima inhibitoria contra S. aureus, así como ampliar el espectro antimicrobiano mediante el ensayo con otras cepas, también causantes de enfermedades respiratorias.
Conflicto de interés
Los autores declaran que no presentan conflicto de interés.
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Recibido: 12 de
diciembre de 2018.
Aprobado: 02 de febrero de 2019.
Mercedes Campo
Fernández
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